Nama : Dini Andriani

Kelas : XIII Kimia Analisis 2

Judul : Penetapan Kadar Kaffein Dalam Minuman Berenergi dengan HPLC

Tujuan : Mengidentifikasi dan menetapkan kadar kafein dalam sampel minuman berenergi
dengan HPLC.
Prinsip : Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya,
setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam
bentuk kromatogram.
Teori : Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen campuran tersebut diantarany dua fase, yaitu fase diam
(stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair,
sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Dalam kromatografi fase
bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam dapat berupa zat padat atau zat
cair. Banyaknya macam-macam kromatografi yang salah satunya adalah kromatografi
gas, yang merupaka metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada zaman
instrumen dan elektronika. Kromatografi gas dapat dipakai untuk setiap campuran
dimana semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti, suhu tekanan uap
yang dipakai untuk proses pemisahan. Tekanan uap atau keatsirian memungkinkan
komponen menguap dan bergerak bersama-sama dengan fase gerak yang berupa gas.
Kromatografi gas metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan campuran yang
sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik untuk
campuran yang sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-
1000 komponen. Metode ini sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah
menguap seperti hidrokarbon dan eter. Analisis minyak mentah dan atsiri dalam buah
telah dengan sukses dilakukan dengan tehnik ini. Efisien pemisahan ditentukan
ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairan, dengan menggunakan
fase cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa (Acun, dkk, 2010).
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung
berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa
kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat
dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan
konsentrasi analat tersebut dalam sample. Teknik HPLC merupakan satu teknik
kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun
analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada
pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan
luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan
data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka
perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Menurut Adnan (1997), komponen utama HPLC adalah :
1. Reservoir pelarut : zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi
tergantung dari senyawa yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bahwa
tempat pelrut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau
udara yang ada dalam pelarut.
2. Pompa : digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobile dengan
kecepatan dan tekanan yang tetap.
3. Injektor : saat sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak
mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Injeksi dapat
menggunakan syringe.
4. Kolom krmatografi : kolom yang dipakai memiliki panjang 10 – 25 cm dan
diameter 4,5 – 5 mm yang diisi dengan fase stasioner beukuran 5-10 mikrometer
dan terbuat dari logam atau stainlessteel.
5. Detektor : digunakan untuk mendeteksi sampel. Detektor dibutuhkan untuk
mempunyai sinsitivitas yang tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan
dapat mendekati eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi.
Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri
makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa
organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul
netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-
 senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah
sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses
industry, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik
untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Cupritabu, 2010). Menurut Khopkar
(1990), zat dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan
partisi cair-cair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan
banyak digunakan dalam industi farmasi dan pestisida. Prinsip umum kromatografi:
Keterangan :
1. Fase gerak
2. Fase diam
3. Kolom
4. Detektor
5. Rekorder
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan
farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali
jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya
adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Alat dan Bahan : 1. Alat
 Blue tip
 Gelas Erlenmeyer
 Gelas ukur 50 ml
 HPLC series 200 dengan detector UV 254 nm perkin elmer
 Kolom: C18 (non polar)
 Label
 Labu ukur 50 ml
 Mikropipet
 Penyaring 0,45 µm
 Pipet volume 5 ml
 Rak tabung reaksi
  Rubber bulb
 Syringe
 Tabung reaksi
2. Bahan
 Aquades (H2O)
 Methanol (CH3OH)
 Larutan standar (kafein murni) 100ppm
 Larutan standar (kafein murni) 200ppm
 Larutan standar (kafein murni) 300ppm
 Sampel Hemaviton
 Sampel Kratingdaeng
Prosedur : 1. Pembuatan Fasa Gerak (Pelarut)
•Siapkan 500 mL larutan 55% air: metanol 45% dan tambahkan 6 tetes 6 M
H2SO4.
•Hidupkan komputer dan alat HPLC, seting sesuai dengan protokol alat HPLC
tersebut dan sesuai dengan kondisi analisa yang digunakan.
2. Analisis Sampel
 Diencerkan dengan methanol 70% (1,5 ml sampel + 3,5 ml methanol) dalam
tabung reaksi san tutup
 Dikocok hingga homogeny
 Disaring dengan penyaring syringe 0,45 µm
 Diambil sampel menggunakan syringe (dilakukan pembuangan pertama dan
dipastikan tidak ada udara pada syringe)
 Dibuka injector pada alat HPLC
 Diinjeksikan sampel ke dalam injector lalu ditutup
 Diamati hasil kromatogram pada computer
3. Larutan standart kaffein (100ppm,200ppm, 300ppm)
 Diambil sampel menggunakan syringe (dilakukan pembuangan pertama dan
dipastikan tidak ada udara pada syringe)
 Dibuka injector pada alat HPLC
  Diinjeksikan sampel ke dalam injector lalu ditutup
 Diamati hasil kromatogram pada computer
 Dibandingkan waktu retensi masing-masing standar dengan sampel.
4. Pengoprasian Alat
 Alat HPLC disambungkan dengan sumber listrik yang benar sesuai dengan
kapasitas alat.
 Tombol ‘ON ‘ ditekan pada sakelar listrik.
 Botol diisi fasa gerak dengan volume yang memadai dan botol penampung
dikosongkan.
 Tombol,ON
 Pada alat ditekan secara berturut-turut untuk power ,detector dan pompa.
 Dilakukan pemrograman alat dengan komputer, sesuai dengan instruksi
dalam komputer.
 Dipilih mode sesuai dengan parameter kondisi instrument.
 Larutan standar diinjeksikan (mulai dengan konsentrasi rendah),selanjutnya
larutan sampel diinjeksikan pula.
 Hasil pengukuran dicetak, dicatat kondisi percobaannya.
 Pompa dimatikan
 File ditutup, komputer dimatikan.
 Tombol‘OFF’pada alat ditekan secara berturut-turut untuk pompa,detector
dan power.
 Alat HPLC diputuskan dari sumber arus listrik.
Data Pengamatan :
 Tabel HPLC standar kaffein
Konsentras Waktu Area (πv* area Height %Height
i (ppm) retensi sec) (eiv)
100 3,646 3458,670 81,36 196.488 81,68
200 3,656 5730,892 80,77 334.292 81,70
300 3,646 9306,385 94,85 486.995 94,88

 Kurva standar kafein

 a. Standar kaffein 100 ppm

b. Standar kaffein 200 ppm

c. Standar kaffein 300 ppm

 Tabel HPLC sampel

Konsentrasi Waktu Area (πv* area Height %Height

(ppm) retensi sec) (eiv)
Hemaviton 3,608 4116.579 30,19 178,782 36,04
Kratingdaeng 3,659 4702.505 35,34 191,688 41,97

 Kurva Sampel
a. Sampel Hemaviton
 b. Sampel Kratindaeng

 Kurva Kalibrasi Standar

y = ax + b
= 3923x + 317601
R′ = 0,9837
  Konsentrasi Sampel

Pembahasan : Pada praktikum kali ini terkait dengan kromatografi yaitu Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau lebih sering disebut HPLC. Teknik HPLC
merupakan suatu metode kromatografi cair-cair yang dapat digunakan baik untuk
keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif ( Wiji, 2010).
Pada praktikum kali ini dilakukan identifikasi kandungan kafein dalam
minuman berenergi yaitu sampel yang digunakan kratingdaeng dengan HPLC.
Kafein adalah suatu senyawa berebntuk Kristal dan berasa pahit yang bekerja
sebagai perangsang psikoaktif dan diuretik ringan.
Percobaan penentuan kadar kafein dalam sampel minuman dilakukan
dengan analisa kualitatif dengan membandingkan waktu retensi standar.
Sedangkan dengan cara analisa kuantitatif dilakukan dengan menghitung
konsentrasi sampel berdasarkan luas area puncak kromatogram dengan metode
kurva kalibrasi dari larutan deret standar. Berdasarkan hasil yang diperoleh jika
dibandingkan hasil kromatogram standar kafein dan kromatogram kafein sampel
terdapat kemiripan waktu retensinya. Dimana waktu retensi pada konsentrasi 100
ppm, 200 ppm, 300 ppm secara berturut-turut yaitu 3,646 menit, 3,656 menit,
3,646 menit. Sedangkan pada sampel hemaviton sebesar 3,608 menit dan pada
 sampel kratingdaeng 3,659. Sehingga dapat dikatakan bahwa peak yang muncul
timbul pada hasil pemisahan komponen kratingdaeng lebih tinggi mengandung
kafein dibandingkan dengan hemaviton. Kemudian untuk menghitung konsentrasi
kafein dalam sampel dilakukan terlebih dahulu dengan membuat kurva kalibrasi
standar untuk memperoleh nilai x, diperoleh nilai a yaitu 3923, nilai b 317601 dan
nilai r 0,9837. Nilai r tersebut mendekati angka 1 sehingga dapat dikatakan kurva
membentuk garis linier. Hubungan konsentrasi dengan luas area yaitu berbanding
lurus, semakin tinggi konsentrasi kafein maka semakin tinggi luas areanya,
berdasarkan tabel hasil pengamatan.
Selanjutnya perhitungan konsentrasi sampel dilakukan dengan cara
menggunakan persamaan y=29239 x + 317601 tadi berdasarkan kurva kalibrasi.
Dimana nilai y dimasukkan angka luas area masing-masing sampel kafein yang
waktu retensinya mirip dengan satndar, untuk kratingdaeng luas areanya sebesar
4702,505 sehingga nilai x untuk kratingdaeng yaitu 149,967 ppm. Sedangkan
hemaviton areanya yaitu 4116579 sehingga nilai x yang didapat untuk hemaviton
129.928 ppm. Lalu dihitung faktor pengenceran, untuk hasil kedua sampel sama
yaitu 3,3 ml dimana volume larutan 5 ml dan volume sampel 1:1,5. Setelah
diperoleh nilai x dan faktor pengenceran maka dapat dilakukanperhitungan
konsentrasi kafein pada sampel dengan cara mengkalinya. Pada kratingdaeng
diperoleh hasil 74,1 mg/150 ml dan pada hemaviton sebesar 64,2 mg/150 ml.
berdasarkan peraturan SNI 01-6684-2002. Bahwa kadar maksimum pada
minuman berenergi adalah 50 mg persaji (BSN,2002). Sehingga pada hasil yang
diperoleh tidak memeunhi syarat
Penggunaan HPLC bekerja bekerja dengan kepolarannya., artinya sampel
akan terpisah berdasarkan sifatkepolaraannya dari masing-masing komponen
dalam fase diam yang digunakan pada metode HPLC ini adalah kolom, injector,
detector, pompa dan pengolah data. Fase gerak yang digunkan yaitu methanol
70% dan aquades 30%.
Kesimpulan : Penetapan kadar kafein dalam sampel dapat dilakukan dengan
membedakan kromatogram kafein standar dengan kromatogram kafein sampel
dicari luas area yang sama atau menghitung konsentasi kadar kafein dala sampel,
dan diperoleh hasil untuk kratingdaeng 74,1 mg/100 ml dan hemaviton 64,2
mg/150 ml. Hubungan konsentrasi dengan luas area yaitu berbanding lurus.
Semakin tinggi konsentrasi kaffein maka semakin tinggi luas areanya.