II.

Teori Dasar

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan

untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia.
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen
campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen
sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik
kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair
adalah hplc (high performance liquid chromatography) atau didalam bahasa
indonesia disebut kckt (kromatografi cair kinerja tinggi). (Sudjadi, 1988)
HPLC (high performance liquid chromatography)  secara mendasar
merupakan  perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom klasik juga
merupakan tipe kromatografi elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara
luas. Teknik hplc merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kualitatif dengan teknik hplc didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada
prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan
data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu,
dilakukan dengan  menggunakan teknik kurva kalibrasi. (wiji, dkk, 2010).

Gambar 1. Instumen HPLC

 Gambar 2. Skema HPLC

(Munson, J.W, 1981)

Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:

 Reservoir (wadah pelarut / cairan)

 Pompa

 Injector (Sistem injeksi sampel)

 Kolom, terdiri dari

1. Kolom Analitik / Kolom Utama

2. Kolom Guard

3. Termostat

 Detektor

 Komputer (Pengolah data)

 (R.P. Budhiraja, 2004)

Mekanisme instumentasi HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan

melalui kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan
ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi
antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya
dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut
yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama.
Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. (Underwood. 2002)
HPLC memiliki beberapa keuntungan dibanding dengan metode
kromatografi lainnya, yaitu :
1. Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis
dan pengolahan data
2. Volume sampel kecil
3. Daya pisah tinggi
Merupakan metode analitis cepat,peka, akurat, tepat, reproducible,
preparative
4. Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik,
bersifat volatil dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara
thermal.
5. Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas.

Namun HPLC juga memiliki beberapa kelemahan, yaitu :

1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaliguS
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

III. Data Fisik dan Kimia

1. Aquabidest bebas pirogen (Aqua Bidestilasi) (Rowe, 2009:776)

(MSDS H2O ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment)
  Pemerian : Cairan, jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak
berasa.
 Kelarutan : Larut dengan kebanyakan pelarut polar.
 pH :7
 Titik didih : 1000C
 Titik beku : 00C
 Stabilitas : Stabil disegala bentuk (es, cair, gas/uap)
 Fungsi : Pembawa atau pelarut.

2. Parasetamol (FI IV, 1995:649) (MSDS Acetaminophen

ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment)

 Pemerian : Hablur atau serbuk hablur

 Warna, rasa, bau : putih, pahit, tidak berbau
 Kelarutan : Larut dalam air mendidih dan natrium hidroksida 1N,
mudah larut dalam etanol.
 pH : 5-7
 Bobot Jenis : 1,293 g/cm3
 Bobot molekul : 151,16 g/mol
 Stabilitas : pada suhu >400C mudah terdegradasi
 Titik leleh : 169-1720C
 Fungsi : Aanalgetik, antiseptik.
3. Metanol Pro HPLC (MSDS Methanol ScienceLab.com Chemicals and
Laboratory Equipment)
 Pemerian : Cairan tidak berwarna, tidak berasa
 Bobot Jenis : 0,7915 g/cm3
 Bobot molekul : 32,04 g/mol
 Titik beku : -980C
 Titik didih : 64,70C
 Titik nyala : 110C
  Perhatian : Dapat menyebabkan iritasi pada mata, kulit, rasa
terbakar, inflamasi, kerusakan kornea, mudah terbakar, dan bersifat
toksik.
IV. Alat dan Bahan
V. Prosedur

VI. Data Pengamatan dan Perhitungan

VII. Pembahasan

Pada percobaan kali ini yang digunkan adalah sistem kromatografi .

kromatografi adalah teknik pemisahan suatu campuran zat menggunakan fase
gerak dan fase diam, dimana pemisahan terjadi akibat adanya perbedaan daya
adsorpsi, kelaruutan, partisi, ukuran moleul, ukuran ion dan tekanan uap pada
komponen yang dibawa oleh fase gerak melaui fase diam (Hendayana, 1994).
Kromatografi yang digunakan adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT/HPLC).

Instrumentasi HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan

komponen dari sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah
pemisahan setiaap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Prinsip
dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. HPLC tidak terbatas pada
senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu
menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu
menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti
polimer. (Hendayana, 1994).
Pada percobaan kali ini digunakan kromatografi adsorpsi. Kromatografi
adsorpsi memiliki fase diam adsorban padatan yang berpi dengan luas permukaan.
Prinsip kromatografi adsorpsi yaitu memisahkan komponen secara selektif 
berdasarkan sifat fisik adsobrs dengan fase. Kecepatan pergerakan suatu
komponen tergantung pada kemampuannya untuk tertahan atau terhambat oleh
penyerap di dalam kolom (Sastrohamidjojo, 2004).
 Pada percobaan kali ini digunakan Kromatograsi fase balik yang dimana
teknik ini menggunakan fase gerak yang bersifat polar dan fase diam besifat non
polar atau kurang polar. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut itu sendiri
yaitu metanol : air. Metanol bersifat semi polar karena pada struktur metanol
memiliki gugus OH dan metil yang berdekatan, air merupakan pelarut universal
yang bersifat polar, sehingga pada fase gerak percampuran pelarut metanol:air
bersifat polar. Fase diamnya digunakan ODS atau Okta Desil Silica. ODS
merupakan kolom berisi silika yang bersifat polar yang kemudian ditambahkan 18
atom C sehingga ODS bersifat non polar. Pada percobaan ini digunakan ODS
karena sifat zat yang digunakan adalah bersifat polar (parasetamol), maka
parasetamol tidak akan tertahan oleh fase diam.

Fase gerak yang digunakan pada kolom reverse phase HPLC adalah
metanol-air yang memiliki drajat pro-analisis. Sebelum dilakukan proses analisis
parasetamol dengan metode HPLC. Pertama-tama dilakukan pengkondisian
kolom. Pengkondisian kolom HPLC meliputi pengaturan tekanan kolom, laju alir
fase gerak, serta pencucian kolom dengan menggunakan metanol-air. Proses ini
dilakukan untuk meningkatkan kepekaan kolom dan menghindari pengotor atau
sisa analit yang masih tertahan pada kolom pada analisis sebelumnya agar tidak
mengganggu analisis dan merusak kolom. Setelah dilakukan pengkondisian
kolom. Selanjutnya dilakukan analisis sampel. Fase gerak maupun larutan yang
dianalisis dialirkan dengan menggunakan sistem pompa.

Pompa dibutuhkan untuk mengalirkan fase gerak dengan tekanan sehingga

dapat mengalir secara terus menerus melalui kolom secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Proses elusi dilakukan dengan cara isokratik
diamana elusi dengan menggunakan komposisi fase gerak yang sama tanpa ada
perubahan perbandingan fase gerak yang digunakan. Semua larutan sebelum
dialirkan ke sistem harus disaring terlebih dahulu dengan membran filter dengan
tujuan yang sama seperti saat menyaring fase gerak yaitu untuk menyaring
pengotor-pengotor bahkan yang berukuran mikro dari pelarut. Adanya pengotor
dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Adanya
partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit,
sehingga dapat menyebabkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut
(Gandjar dan Rohman, 2007).

Injeksi larutan standar dan sampel ke dalam HPLC harus dilakukan

dengan hati-hati dan dijaga agar tidak ada gas yang terinjeksikan sebab adanya
gas dapat menimbulkan gelembung dan pengumpulan gas pada komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Sehingga
hasil analisisnya tidak baik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pada saat praktikum larutan standar dan sampel-sampel cair disuntikan

sebesar 40 µL. Hal ini dilakukan untuk mengantisipasi cairan yang mungkin.
Detektor yang digunakan pada HPLC ini adalah detektor photodiode array(PDA).
Detektor ini merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor
ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada 40 panjang
gelombang yang berbeda dalam sekali proses ( single run). Selama proses
berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan dapat
ditampilkan. Dengan detektor ini akan diperoleh spektrum UV tiap puncak yang
terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih
panjang gelombang maksimal untuk sistem HPLC yang digunakan(Gandjar dan
Rohman, 2007).

Sebelum diinjeksikan, larutan standar disaring terlebih dahulu. Perlu

diperhatikan pada saat penyuntikan larutan ke dalam injektor tidak boleh terdapat
gelembung pada syringekarena dapat mengganggu pengamatan dan gas dapat
menimbulkan gelembung dan pengumpulan gas pada komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Uji kualiatif adanya parasetamol dilakukan dengan cara mencocokan batas

spektrum yang diperoleh dengan spektrum standar parasetamol yang telah
tersedia. Secara kuantitatif berdasarkan perhitungan diperoleh kadar 100,5%.
Selain itu juga dilakukan uji kesesuain sistem. Uji kesesuaian sistem untuk
menilai apakah sistem kromatografi yang diset sudah memenuhi syarat atau
tidak,makadilakkan uji kesesuaian sistem. Uji dilakukandengan menginjeksikan
berturut-turut sebanyak7 kali larutan standar ke dalam instrument KCKT.
Selanjutnya luas area standar,waktu retensi, faktorikutan dihitung nilai simpangan
baku relative (SBR) nya. Uji kesesuaian sistem dunyatakan memenuhi syarat
apabilanilai SBR <2,0 %. Pada praktikum ini uji kesesuaian sistem memenuhi
syarat karena didapat nilai SBR 0,9922651212%.

DAFTAR PUSTAKA

Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age International
(p) Ltd.
Day, R.A., A.L. Underwood. (2002). Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta:
Erlangga.
Dirjen POM. (1995) . Farmakope Indonesia Edisi IV . Jakarta: Departemen
Kesehatan Republik Indonesia.
Gandjar, I.G., dan Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:
Pustaka Pelajar.
Hendayana, Sumar. (1994). Kimia Analitik Instrumen.Semarang:Semarang Press.
Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A and B,
diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga University Press,
Surabaya.
MSDS “Methanol” ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment
MSDS “Acetaminophen” ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment
MSDS “H2O” ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment
Rowe, Raymond C. 2006.  Handbook of Pharmaceutical Excipients 5th ed
London:Pharmaceutical Press.
Sastrohamidjojo, H. 2004. Kimia Minyak Atsiri.Yogyakarta : Gadjah Mada
University Press
Sudjadi. Metode Pemisahan. Fakultas Farmasi UGM:  Yogyakarta. 1988
Wiji, dkk. (2010).  Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen. Bandung :
Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA Universitas Pendidikan Indonesia