HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah metoda kromatografi

cair bertekanan tinggi. HPLC sangat berguna untuk analisis kimia secara kualitatif dan
kuantitatif senyawa organic atau anorganik yang berkadar sangat kecil, dalam skala ng/L.
juga metoda ini hanya memerlukan jumlah cuplikan yang sangat kecil(ml). oleh karena itu
HPLC, misalnya dapat digunakan dalam analisis cuplikan Kimia Lingkungan, Farmasi, atau
kedokteran. (Tim Dosen Kimia Instrumen.2001:1)
Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area
puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/ area standar. Pada prakteknya
teknik perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu
konsentrasi standar. Oleh karena itu, lebih akurat dilakukan dengan menggunakan teknik
kurva kalibrasi.
Kromatografi menyangkut metode pemisahan yang didasarkan atas distribusi
differensial komponen sampel diantara dua fasa. Menurut pengertian ini kromatografi selalu
melibatkan dua fasa ,yaitu fasa diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Fasa
diam berupa padatan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu
adsorben) sedangkan fasa gerak berupa cairan disebut eluen. Fase gerak ini mengakibatkan
terjadinya migrasi differensial komponen-komponen dalam sampel. (budiasih,dkk.199:68)
Prinsip kerja HPLC adalah berdasarkan distribusi differensial komponen di antara
dua fasa yang disebabkan oleh perbedaan kepolaran. Prinsip kerja alat instrument HPLC
adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam
kolom terjadi pemisahan komponen – komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solute – solute terhadap fasa diam. Solute – solute yang kurang kuat
interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute –solute
yang kuat interaksinya dengan fasa diam maka solute –solute tersebut akan keluar dari kolom
lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram GC,
jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem
HPLC.
 Terdapat dua perbedaan dalam HPLC berdasarkan polaritas dari pelarut dan interaksi
terhadap fasa diamnya.
1. Fasa normal HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat lebih polar daripada
pelarutnya.
2. Fasa balik HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat non-polar dibandingkan dengan
pelarutnya.
Fasa gerak dalam HPLC adalah zat cair. HPLC mempunyai lebih banyak pilihan
fasa gerak. Dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen – komponen
campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute – solute. Oleh
karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu factor penentu keberhasilan
proses pemisahan.
a. Persyaratan fasa gerak HPLC
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi
beberapa persyaratan berikut :
1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang
dianalisis.
2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan dalam
kolom
4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun
5) Zat cair tidak kental
6) Fasa gerak harus sesuai dengan detektor
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari
gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjadinya pemisahan
campuran menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya kolom utama dapat
digunakan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang
keluar dari kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan
dengan fraction colector. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan
kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
 Pelarut dalam HPLC diantaranya n-heksana, sikloheksana, tetraklorometana,
metilbenzena, isopropanol, etanol, methanol, asam etanoat, dan air. Sementara fasa diam
dalam HPLC diantaranya oktilsilika, propilsilika, aminopropil, asam sulfonat, dan amina
kuartener. (al-anshory,2007:2-6)

Parasetamol, KAFEIN, DAN ASETOSAL umumnya terdapat bersama-sama

dalam satu tablet obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan dapat menyerap sinar UV. (Tim Dosen Kimia
Instrumen.2011:17)
PEMERIAN:
Parasetamol berwujud serbuk hablur berwarna putih tidak berbau dan sedikit
pahit. Mengenai kelarutannya parasetamol larut dalam air mendidih dan dalam NaOH
1N, mudah larut dalam etanol, memiliki rumus empiris C8H9NO2 .Adapun struktur kimia
parasetamol adalah:

Gambar: struktur parasetamol

Kafein dengan rumus empiris C8H10N4O2 adalah senyawa alkaloid xantina
berbentuk Kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perangsang psikoaktif dan
diuretic ringan. Adapun struktur kimia darikafein adalah :

Gambar: Struktur Kafein

(Sudjadi,Rahman.1994:36)
Al-Anshory, Jamaludin. 2007. Diktat Pelatihan HPLC. Bandung : Universitas Padjadjaran

Budiasih, Endang, dkk. 1999. Analisis Instrumentasi. Malang: Universitas Negeri Malang

Sudjadi dan Rahman, A. 1994. Analisis Obat dan Makanan. Yogyakarta: Pustaka Pelajar

Tim Dosen Kimia Analitik. 2013. Petunjuk Praktikum Kimia Instrumen. Bandung: LKI
Universitas Pendidikan Indonesia