MAKALAH ANALISIS FARMASI

HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

“minuman”

OLEH:

SITTI SYARIFAH (O1A114049)

MARWAH PUSPITASARI (O1A114075 )

WA ODE HELMINAH (O1A114061)

JURUSAN FARAMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2016
 KATA PENGANTAR
Puji syukur kita panjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas limpahan
Rahmat dan Karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan Makalah Analisis Farmasi
yang berjudul “HPLC pada Makanan” ini.

Atas bimbingan dosen, tidak lupa penulis ucapkan terima kasih yang
sebesar-besarnya, dan begitu pula pada teman-teman kelompok yang telah
mendukung sehingga penyusunan makalah ini dapat terselesaikan.
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa Makalah Anlisis Farmasi ini masih
banyak terdapat kekurangan ataupun kesalahan baik dari segi isi maupun dari segi
pengetikan. Oleh karena itu, kritik dan saran yang membangun dari semua
pembaca dibutuhkan demi kesempurnaan makalah ini.

Kendari, November 2016

Penulis
 DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR
DAFTAR ISI
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang……………………………………………………………..
1.2 Rumusan Masalah………………………………………….….……………
1.3 Tujuan Penulisan……………………………………………………………
BAB II PEMBAHASAN
2.1 Pengertian Kromatografi Cair Kinerja tinggi……………………………….
2.2 Prinsip Kerja Kromatografi Cair Kinerja tinggi ……………………………
2.3 Kelebihan dan kekurangan Kromatografi Cair Kinerja tinggi …...………..
2.4 Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa ....................…………………..
BAB III PENUTUP
3.1 Kesimpulan……………………………………………………………….
DAFTAR PUSTAKA
 BAB I
PENDAHULUAN

I.I. Latar Belakang

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis
material untuk mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara
tradisional, kimia analitik dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif.
Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau
senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis kuantitatif
bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu
cuplikan. Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target
dan metode. Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia
bioanalitik, analisis material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik.
Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi,
spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi, mikroskopi,
dan elektrokimia.
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur
yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini
membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang
lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang
stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa
gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas.
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion
adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini
digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan
dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya
cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup
menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam.
Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah
dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis
kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu
menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid
chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC
menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran
partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang
tinggi.

I.2. Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam makalah ini adalah
1. Apa yang dimaksud dengan HPLC
2. Bagaimana prinsip kerja HPLC?
3. Apa kelebihan dan kekurangan HPLC?
4. Bagaimana Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa?

I.3. Tujuan
Tujuan dalam pembuatan makalah ini adalah :
1. Untuk mengetahui pengertian dari HPLC
2. Untuk mengetahui prinsip kerja HPLC
3. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan dari HPLC
4. Untuk mengetahui penerapan HPLC dalam analisis senyawa
I.4. Manfaat
Manfaat dalam pembuatan makalah ini adalah :
1. Mampu mengetahui pengertian dari HPLC
2. Mampu mengetahui prinsip kerja HPLC
3. Mampu mengetahui kekurangan dan kelebihan dari HPLC
4. Mampu mengetahui penerapan HPLC dalam analisis senyawa
 BAB II
PEMBAHASAN
2.I. Pengertian
HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis
dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara
lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.
HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair – cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif
dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar.
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang
tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
HPLC secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah
pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan
tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan
komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru
antara lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-
asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa
kiral.
2.2. Prinsip Kerja
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk
sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Urutan skala polaritas : golongan
fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter <
golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses
kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat
Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard
umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu
dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan
mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua
zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan,
meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang
dianalisis di dalam sampel.  Yang berperan dalam proses separasi pada system
HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa,
misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein,
lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk
tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus
digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan
proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa
mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya
adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal
kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang
menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa
dalam eluat : 
a. Fasa Normal 
 Fasa gerak nonpolar 
 Fasa diam polar 
b. Fasa Terbalik 
 Fasa gerak polar 
  Fasa diam nonpolar 
Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat
ditingkatkan dengan mengoptimasi parameter-parameter HPLC yaitu retensi,
selektifitas, dan efisiensi. Secara praktis parameter-parameter HPLC tersebut
dapat dioptimalkan dengan mengubah : 
 Komposisi dari fase gerak 
 Laju alir 
 Sifat kimia dari fase gerak 
 Jenis kolom Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan
sekaligus kualitatif. 
Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel
dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan
untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan : Cx = Ax / Ap X Cp 
Keterangan : 
- A = Peak area = Luas puncak 
- C = Konsentrasi 
- X = sampel 
- P = pembanding 

Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan
dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar. HPLC yaitu alat yang
berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam (yaitu sebuah
tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan
memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang
akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah
melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. 
Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik. Waktu
saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu
karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan
kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan
menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat
organik seperti metanol. HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti asam
formiat dan asam asetat. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-
distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak
terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa
menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling
bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan
konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan
preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC
sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah
karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya
hanya melalui proses pelarutan saja.

2.3. Kelebihan dan Kekurangan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan
fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini
jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain: 

1. Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran 

2. Mudah melaksanakannya 
3. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi 
4. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis 
5. Resolusi yang baik 
6. Dapat digunakan bermacam- macam detektor 
7. Kolom dapat digunakan kembali 
8. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali
cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang
dianalisis. 
9. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan
panas 
10. Banyak pilihan fasa geraknya Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1
jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk
 analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit
bisa dicapai 
11. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa
diam. 
12. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa
gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang diinginkan. 
13. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat. 
14. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC 
15. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis
yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang
diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan 
16. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk
menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal
sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut. 
17. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC
tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
dikumpulkan setelah melewati detector. 
18. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk
kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus. 
Kekurangan HPLC 
1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu 
2. Hanya bisa digunakan untuk asam organic 
3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan
gradient elusi 
4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang
terbatas.

2.4. Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa pada Minuman

Jus buah dalam bentuk kemasan adalah salah satu sumber minuman yang
memiliki karbohidrat, gula, vitamin dan mineral. Jus buah disintesis dari bulir
buah-buahan seperti jeruk, mangga, jambu, apel, aprikot, nanas, lemon, jeruk
nipis dan peach, karena buah memiliki peranan penting pada diet manusia dan
suplemen makanan yang sehat karena mengandung karbohidrat, protein, vitamin
A, B1, B2, C, D dan E; dan mineral seperti Ca, Mg, K, Zn dan Fe. Selain itu
minuman jus yang dikemas lebih dapat diterima karena beberapa faktor seperti
kenyamanan, biaya murah.
Namun dalam pengolahan membuat jus ekstrak untuk kemasan, mengalami
modifikasi yang luar biasa terhadap kualitas produk sehingga bisa mengurangi
nlai gizi pada minuman. Vitamin-C adalah konsentrat terkandung dalam jus buah
yang paling banyak berkurang dalam proses ini, karena vitamin-C sangat peka
terhadap berbagai kerusakan. Hilangnya asam askorbat dalam jus dipengaruhi
oleh suhu, konsentrasi garam dan gula, pH, oksigen, cahaya, katalis loga,
konsentrasi awal asam askorbat, cemaran mikroba dan perlindungan yang
diberikan oleh kontainer.
Oleh karena itu penulis akan menganalisis kandungan vitamin-C pada
minuman jus kemasan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).

Bahan dan Metode

Kimia dan Reagen
Vitamin-C (Ekstra murni, sampel pada hari-1 dan hari-2), metanol, asetonitril,
HPLC, kalium dihidrogen fosfat dan asam fosfat meta ekstra murni dari
(BDHEngland). Air deionisasi dan Pelarut dari LC kelas diperoleh dengan
penyaringan melalui filter membran 0.45μm dan gasnya selama 20 menit dengan
ultra-sonic cleaner.

Metode Validasi
parameter metode validasi dipelajari adalah batas deteksi (LOQ), batas
kuantifikasi (LOD), linearitas, pengulangan dan akurasi. LOQ adalah
didefinisikan sebagai konsentrasi terendah yang bisa ditentukan dengan akurasi
yang dapat diterima dan presisi. LOD ditentukan dengan menipiskan solusi yang
diketahui konsentrasi sampai respon itu tiga kali kebisingan sementara LOQ
didefinisikan sebagai konsentrasi terendah yang dapat ditentukan dengan akurasi
yang dapat diterima dan ketelitian. LOQ dihitung atas dasar minimal nilai yang
diterima dari S/N 10. Linearitas ditentukan dengan kurva kalibrasi. Untuk
pembangunan disiapkan dan masing-masing larutan standar disuntikkan sekali.
Pengulangan diperkirakan dengan pengujian enam mereplikasi sampel pada hari-1
dan hari-2 oleh tekad pemulihan.
Tabel 1. penggunaan KCKT untuk analisis sampel minuman

sampel Fase Fase Gerak Detektor

Diam

Jus kemasan yang C 18 Fase berair terdiri dari Kalium spektrofotometer

mengandung ortofosfat dihidrogen dan asam UV -VIS
asam askorbat meta fosfat, buffer fase
organik adalah metanol dan
asetonitril

Hasil
Waktu retensi adalah dalam 1,63-1,65 menit. Kurva standar yang linear atas
kisaran konsentrasi 0,1 sampai 2,5 mg / ml. Pemulihan ekstraksi itu berjarak 94
dan 101%. Metode yang diusulkan ditemukan menjadi cepat, akurat, berulang dan
konsisten. Metode ini juga dibandingkan dengan metode- oxidation pengurangan
menggunakan standar 2,6-Dichloroindophenol (DCP), untuk mengukur tingkat
asam askorbat. Dalam hasilnya penulis menemukan bahwa Sebagian besar
perusahaan lokal tetra dalam mengemas jus melebih-lebihkan kandungan
sebenarnya dari vitamin-C.
 BAB III
PENUTUP

3.1. Kesimpulan
a. HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile
(gerak) dan fase stasioner (diam). 
b. Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan
tertentu sebagai fasa geraknya
c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu
menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang
tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya,
mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT
tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan
instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan
kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu,
hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang
optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga
penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas.
d. KCKT dapat diterapkan pada analisis senyawa yang terdapat dalam sampel
jus kemasan. Hasil yang diperoleh kandungan yang tertera pada kemasan jus
tidak sesuai dengan kandungan yang terdapat pada sampel. Hasil tersebut
dapat dipercaya karena metode yang digunakan telah tervalidasi.
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

Airlangga University Press. Surabaya.1995.

Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas

Padjajaran. Bandung.

Putra, Effendy D. L., 2004. ’Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam

Bidang Farmasi’ J. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3-6.

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia
Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran
EGC,Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif,

Erlangga,Jakarta.

Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press.

Ullah Shafqat, Arshad Hussain, Javid Ali, Khaliqurrehman and Asad

ullah. 2012. A Simple and Rapid HPLC Method for Analysis of
Vitamin-C in Local Packed Juices of Pakistan. Middle-East
Journal of Scientific Research. 12 (8): 1085-1091