INSTRUMENTASI

HPLC
(High Pressure Lliquid Chromatography)
Ade Egie Prayogi
Cindy Destiani
Sidiq Alimul Hakim

FARMASI E
 Pengertian HPLC
• Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa
juga disebut dengan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak
destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif dan kuantitatif. Ini merupakan salah satu
teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya
disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik
kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk
memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
afinitasnya terhadap zat padat tertentu. KCKT paling
sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-
asam nukleat,dan protein-protein dalam cairan
fisiologis, menetukan kadar senyawa-senyawa aktif
obat, produk hasil samping proses sintesis, atau
produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.
• Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC
berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu.
Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan
zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini
sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa
sekaligus karana setiap senyawa mempunyai afinitas
selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak
tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita
akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat
waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
 Prinsip HPLC

Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah

memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya
diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing
masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan
untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam
suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah
dan konsentrasi analat tersebut dalam samplel

Pada prinsip kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit

berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa
diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
 Fungsi HPLC

• Penggunaan alat HPLC sangat erat kaitannya dengan

dunia industri obat dan makanan. Fungsi HPLC adalah untuk
menentukan atau mengukur atau menganalisa kadar bahan
aktif pada suatu sample (obat, makanan atau herbal). Pada
beberapa kasus yang berhubungan dengan obat herbal, alat ini
digunakan untuk menentukan marker pada suatu obat herbal.
untuk menguji sampel makanan dan minuman seperti beberapa
zat aditif (pewarna, pengawet, perasa dan lain-lain), obat-
obatan, pewarna tekstil, pestisida, lemakbabi, protein, vitamin,
karbohidrat, gula, cafein, plasma dan sebagainya.
 Komponen HPLC
1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut
Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi. Idealnya, pelarut khusus yang memang
sudah memenuhi standard untuk HPLC dipergunakan untuk hasil yang lebih akurat. Reservoir pelarut merupakan wadah
penyimpanan fase gerak, biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung. Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat
cair dan disebut juga pelarut. Selai berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector,
fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan.
 Komponen HPLC
2. Pompa
Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang
berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk
halus.
Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:
1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2)
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit
4. Bahan tahan korosi

3. Injektor
Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC. Proses injeksi
dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan menggunakan sistem
injeksi otomatis. Injektor pada HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam
kisaran volume 0.1-100 Ml.
4. Sampel
Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC harus bersifat bening dan
tidak ada endapan, untuk itu preparasi sampel diperlukan sebelum dianalisis,
misalnya dengan melakukan filtrasi sampel. Preparasi lain dapat pula
dilakukan sesuai kebutuhan seperti mengatur konsentrasi sampel, desalting,
dan lain-lain.
5. Kolom HPLC
Aktivitas utama dalam HPLC terjadi di dalam kolom sebagai fase diam. Di dalam kolom akan terjadi pemisahan
komponen sampel yang kemudian dapat dihitung waktu retensi masing- masing komponennya oleh detektor.
Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa komponen sampel untuk melewati kolom menuju
detektor. Waktu retensi dihitung dari saat sampel diinjeksikan hingga puncak pembacaan maksimum pada
detektor. Senyawa yang berbeda akan memiliki waktu yang berbeda sehingga masing-masing konsentrasinya
dapat dihitung. Kolom HPLC tersedia dalam panjang serta packing material yang berbeda-beda tergantung dari
jenis HPLC yang hendak digunakan. Packing material merupakan material yang diisikan ke dalam kolom sebagai
fase diam. Packing material yang sering digunakan biasanya yang berbasis silika, baik silika yang tidak
dimodifikasi maupun yang telah termodifikasi seperti oktadesil silika (ODS) yang memiliki lapisan C18.
6. Detektor
Alat ini berfungsi untuk mendeteksi keberadaan komponen yang telah melewati kolom dan
memberikan sinyal elektronik pada pengolah data. Terdapat beberapa jenis detektor HPLC
tergantung dari karakteristik yang hendak dibaca. Misalnya pada detektor jenis UV-vis, maka
karakteristik yang dibaca oleh detektor adalah absorbansinya. Detektor jenis lain yang bisa
digunakan adalah detektor indeks bias, fluoresensi, serta detektor elektrokimia.
 Syarat Sampel HPLC

1. Sampel berupa turunan dari senyawa gula, etanol.

2. Sampel tidak mengandung asam an organik.
3. Jika berupa padatan sampel harus larut dalam methanol.
4. Sampel tidak mengandung zat warna.
5. Sampel ditempatkan dalam wadal vial (botol kaca).
6. Sampel harus dilengkapi dengan sampel senyawa standar
yang menjadi target.
7. Standar yang di-inject dihitung sebagai sampel
TERIMA KASIH