LABORATORIUM KIMIA FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

LAPORAN PRAKTIKUM INSTRUMENTASI

VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR ASAM SALISILAT PADA
SAMPEL (Clean and Clear) MENGGUNAKAN METODE HPLC

NAMA : NUR AFNI ANGGRAENI A

STAMBUK 150 2020 0240
KELAS : C11A-
C12A KELOMPOK :
1(SATU)
ASISTEN : LA ODE MIFTAHUL ARZAK

PROGRAM STUDI SARJANA

FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA
MAKASSAR
2021
 VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR ASAM SALISILAT PADA
SAMPEL (Clean and Clear) MENGGUNAKAN METODE HPLC

BAB 1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Validitas adalah suatu ukuran yang menunjukan tingkat kevalidan atau
kesahihan suatu instrument. Suatu intrumen dikatakan atau dianggap valid
apabila mampu mengukur apa yang diinginkan. Dengan kata lain, mampu
memperoleh data yang tepat dari variable yang diteliti. Secara Umum
Validasi diartikan sebagai suatu tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai
bahwa tiap bahan, proses, prosedur, kegiatan, sistem, perlengkapan atau
mekanisme yang digunakan dalam produksi
dan pengawasan akan senantiasa mencapai hasil yang diinginkan.

Caffeine atau kafein adalah zat kimia yang ditemukan pada kopi, teh, cola,
guarana, mate, dan produk-produk lain. Kafein umumnya digunakan untuk
meningkatkan kewaspadaan mental, namun kafein memiliki banyak kegunaan
lain.
Tablet adalah sediaan padat kompak, dibuat secara kempa cetak, dalam
bentuk tabung pipih atau sirkuler, kedua permukaannya rata atau cembung,
mengandung satu jenis obat atau lebih dengan atau tanpa zat tambahan. Zat
tambahan yang digunakan dapat berfungsi sebagai zat pengisi, zat
pengembang, zat pengikat, zat pelicin, zat pembasah atau zat lain yang cocok.
HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography) merupakan tipe
kromatografi elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. teknik
ini digunakan oleh para kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-
spesi dalam berbagai bahan atau senyawa.
Kromatografi adalah sebuah teknik dalam penelitian yang digunakan
untuk memisahkan komponen campuran menjadi bagian- bagian partikel
penyusun komponen tersebut. Hal ini dilakukan untuk melakukan pemurnian
terhadap sebuah komponen campuran dengan melihat karakteristiknya seperti
ukuran, massa, bentuk, dan lainnya. Kromatografi merupakan teknik
pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak
NUR AFNI ANGGRAENI A LA ODE MIFTAHUL ARZAK
15020200240
 VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR ASAM SALISILAT PADA
SAMPEL (Clean and Clear) MENGGUNAKAN METODE HPLC
dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada
pada larutan.

Maksud Praktikum
Adapun maksud dari praktikum ini adalah mampu mempraktekkan
bagaimana cara melakukan valisasi metode analisis Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi dan menentukan kadar kofein dalam sediaan tablet
dengan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah:
1. Untuk mempraktekkan bagaimana cara melakukan valisasi metode
analisis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi,
2. Menentukan kadar kofein dalam sediaan tablet dengan metode
Kromatografi Cair Kinerja Tingg

NUR AFNI ANGGRAENI A LA ODE MIFTAHUL ARZAK

15020200240
 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Teori Umum
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk
atau dalam sediaan farmasetik, serta obat dalam biologi (Rohman 2009, h.111).
Kegunaaan umum KCKT adalah untuk pemisahan dan pemurniaan senyawa
obat serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan farmasetika
(Gandjar &Rohman 2012 h.417).
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah
satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat
luas pada solven yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat
umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus (Effendy De Lux Putra, 2004):
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena
prosedur pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari
semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
(Effendy De Lux Putra, 2004).

Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk

KCKT/HPLC yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat
diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang
terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam
detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be
useless). Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan
kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh :kolom berikatan dengan NH2)
(Effendy De Lux Putra, 2004).
Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah (R.P. Budhiraja,
2004) :
1. Reservoir (wadah pelarut / cairan)
2. Pompa
3. Sistem injeksi sampel
4. Kolom, terdiri dari
5. Kolom Analitik / Kolom Utama.
6. Kolom Guard
7. Termostat
8. Detektor
9. Komputer (Pengolah data)

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan

digunakan dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-
masing reservoir dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini
berfungsi untuk mengatur cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom
(R.P. Budhiraja, 2004).
Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa.
Pelarut dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom.
Pompa yang digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut (R.P.
Budhiraja, 2004) :
1) Harus memiliki aliran terkontrol yang „reproducible‟
2) Harus menghasilkan aliran yang „pulse-free‟ (bebas pulsa, tidak
menghasilkan gelembung)

3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil

Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat
diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu,
sampel dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan
tersedia pada volume 0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling
loop terisolasi dari fasa gerak dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe
dengan kapasitas beberapa kali dari loop sampling digunakan untuk menempatkan
sampel kedalam loop (Harvey David, 2000).

Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel
dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari
sekitar 30 mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer
partikel-partikel silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical.
Kolom ini berfungsi sebagai tempat pemisahan berlangsung (Harvey David,
2000).

Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa

hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel
menurunkan performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang.
Kedua, material partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat
kolom analitik. Maka dari itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik
untuk meminimalisasi masalah-masalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi
material partikulat packing dan fasa diam yang sama dengan kolom analitik,
namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5 mm dan harganya satu
persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard digunakan
sebagai “tumbal” dan diganti secara berkala (Harvey David, 2000).
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan
index refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali
komponen-komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip (Harvey
David, 2000).

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam

banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan
yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada
KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil
pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun
demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan
yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer
pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas
detektor UV Visibel yang umumnya digunakan (Effendy De Lux Putra, 2004).
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair
klasik, antara lain (Effendy De Lux Putra, 2004) :
1. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis
yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang
tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit
bisadicapai.
2. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua
rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang
mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan
terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat
berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada
KCKT
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
3. Sensitivitas detector : Detektor absorbsi UV yang biasa
digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah
nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-
detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti
Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat
juga digunakan dalam KCKT.
4. Kolom yang dapat digunakan Kembali : Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom
 yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari
solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul
besar dan berionik :zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisi
spsesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal
sekali untuk mengalissis zat –zat tersebut.
5. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam
KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel
yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan
mudah dikumpulkan setelah melewati detector.Solvennya dapat
dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukarion
memerlukan prosedur khusus.
Uraian Bahan
1. Asam Salisilat (Ditijen POM, 2014 : 156)
Nama Resmi : ACIDUM SALIYLICUM
Nama Lain : Asam Salisilat
Rumus Molekul : C7H6O3
Berat Molekul : 138,12 g/mol
Rumus Struktur :

Pemerian : Hablur, biasanya berbentuk jarum halus atau

serbuk halus; putih; rasa agak manis, tajam dan
stabil di udara. Bentuk sintesis warna putih tidak
berbau. Jika dibuat dari metil salisilat alami
dapat berwarna kekuningan atau merah muda
dan berbau lemah mirip mentol.
Kelarutan : Sukar larut dalam air dan dalam benzene,
mudah larut dalam etanol dan dalam eter, larut
 dalam air mendidih, agar sukar larut dalam
kloroform.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik. Kegunaan
: Sebagai bahan dasar sintesa aspirin.
2. Aquadest (Ditjen POM, 1979 : 96)
Nama Resmi : AQUA DESTILLATA
Nama Lain : Air suling, aquadest
Rumus Molekul : H2O
Berat Molekul : 18,02 g/mol
Rumus Struktur :H–O–H
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak
berasa, dan tidak berbau.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.
Kegunaan : Sebagai pelarut.
3. Kafein (Ditjen POM,1979 : 175)
Nama Resmi : COFFEINUM
Nama Kimia : C8H10N4O2
Sinonim : Kafein
Berat molekul : 194,19 g/mol
Pemerian : Serbuk atau hablur berbentuk jarum mengkilat
biasanya menggumpal, putih, tidak berbau, rasa
pahit.
Kelartutan : Agak sukar larut dalam air, mudah larut
dalam etanol (95%), larut dalam kloroform ρ
dan dalam eter ρ.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.
Kegunaan : Bahan uji/ Sampel.
4. Metanol (Ditjen POM, 1979 : 706)
Nama Resmi : Metanol
Nama Lain : Metanol
Rumus Molekul : CH3COH
Berat Molekul : 34,00 g/mol
Rumus Struktur : CH3-OH
 Pemerian : Cairan tidak berwarna, gliserin, bau khas.
Kelarutan : Bercampur dengan air, membentuk cairan
jernih tidak berwarna.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup.
Kegunaan : Sebagai pereaksi.
5. Asam Asetat (Ditjen POM, 1979 : 793)
Nama Resmi : ACIDUM ACETIKUM
Nama Lain : Asam Asetat
Berat Molekul : 60,05 g/mol
Rumus Molekul : CH3COOH
Rumus Struktur :

Pemerian : Ciran jernih, tidak berwarna, bau khas

menusuk, rasa asam yang tajam.
Kelarutan : Dapat bercampur dengan air, dengan etanol
dan gliserol.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat.
Prosedur Kerja (Anonim, 2021)
a. Pembuatan fase gerak standar dan fase gerak sampel.
Mencampurkan pelarut methanol : aquadest : asam asetat glasial (140
: 60 : 6), diatur hingga pH 3.
b. Pembuatan larutan standar.
1. Sebanyak 25 mg asam salisilat ditimbang seksama, dilarutkan dalam
fase gerak dengan komposisi methanol : aqua dest : asam asetat glasial
(A) dalam volume 10 mL.
 2. Kemudian dibuat 5 seri konsentrasi 500, 250, 100, 25, dan 2,5 ppm.
3. Campuran dihomogenkan dan disaring dengan filter holder, membrane
filter (milllipore) 0,45 μm.
c. Pembuatan larutan sampel.
Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan dalam labu ukur 10 mL (500
ppm), kemudian diencerkan menjadi 4 seri konsentrasi lainnya
: 250, 100, 25, dan 2,5 ppm.
d. Penentuan panjang gelombang maksimum.
Larutan standar asam salisilat 2,5 ppm diukur menggunakan
Spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 200-400 nm.
e. Pengkondisian alat kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
1. Optimasi kondisi analisis dilakukan pada standar asam salisilat dengan
mengubah komposisi fase gerak dan laju alir yang digunakan,
menggunakan kecepatan alir 1 mL/menit.
2. Kondisi KCKT yang digunakan adalah kolom C18 dengan
menggunakan detector PDA pada panjang gelombang 270 nm.
f. Uji kesesuaian system.
1. Larutan standar asam salisilat 2,5 ppm larutan disaring menggunakan
dengan filter holder, membrane filter (milllipore) 0,45 μm, kemudian
diinjeksikan sejumlah 20 μL melalui injector ke dalam KCKT,
menggunakan kondisi optimum yang diperoleh.
2. Hasil pengujian yang diperoleh dicatat dan dibandingkan dengan
kriteria uji kesesuaian system antara lain yang digunakan untuk
menentukan kadar penyuntikan larutan baku, yang dinyatakan dalam
waktu retensi, luas puncak, tinggi puncak, faktor kapasitas/factor
retensi, Resolusi, selektivitas, efisiensi kolom, jumlah pelat teori (N),
Jarak setara pelat teori (JSPT).
g. Validasi Metode.
1. Pembuatan kurva kalibrasi standar.
1. Asam Salisilat dibuat dengan konsentrasi 2,5; 25;100; 250 dan 500
ppm, larutan disaring menggunakan dengan filter holder,
membrane filter (milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan
sebanyak 20 μL ke system KCKT.
2. Kurva kalibrasi dibuat dengan memplotkan luas area dengan
konsentrasi dari Asam Salisilat dan dihitung persamaan regresi.
2. Uji Linearita.
1. Asam Salisilat konsentrasi 2,5; 25;100; 250 dan 500 ppm,
larutan disaring menggunakan dengan filter holder, membrane
filter (milllipore) 0,45 μm.
2. kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke system KCKT.
3. Uji batas deteksi dan batas kuantitasi.
1. Untuk pengujian batas deteksi dan batas kuantitasi dilakukan
berdasarkan perhitungan nilai noise dari alat KCKT yang
digunkaan.
2. Persyaratan batas deteksi adalah tiga kali noise dan batas kuantitasi
adalah sepuluh kali noise.
3. Kemudian dilakukan perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi
alat dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
3𝑥𝑛
BD = x konsentrasi yang diinjeksiakn
ℎ𝑎
1𝑥
BK = x konsentrasi yang di njeksikan
𝑛ℎ 𝑎
4. Uji Presisi.
1. Larutan uji presisi dibuat dengan cara larutan konsentrasi 2,5
ppm larutan disaring menggunakan dengan filter holder,
membrane filter (milllipore) 0,45 μm kemudian diinjeksikan
 sebanyak 20μL ke system KCKT pada kondisi yang
ditentukan.
2. Pengukuran dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan.
3. Kemudian hasil yang diperoleh dihitung nilai persen
simpangan baku relative (RSD).
5. Uji akurasi.
1. Uji akurasi dilakukan dengan menggunakan metode standar adisi.
2. Sampel dianalisis lalu dengan menambahkan sejumlah larutan
standar dengan konsentrasi 80%, 100% dan 120% dari kadar analit
yang diperkirakan kedalam sampel yang akan dianalisis yang
dilarutkan dengan fase gerak asetonitril
: air konsentrasi 10%.
3. Larutan disaring menggunakan dengan filter holder, membran
filter (milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL
ke system KCKT.
4. Pengukuran dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.
5. Hasil yang diperoleh dicatat dan dihitung persen perolehan
kembali dari analit tersebut.
6. Spesifisitas.
1. Pengujian spesifisitas dilakukan pada larutan standar, larutan
sampel dan blanko dengan cara melihat nilai resolusi dari larutan
tersebut.
2. Injeksikan larutan standar, larutan sampel dan larutan blanko ke
sisitem KCKT masingmasing sebanyak 20μL pada kondisi yang
ditentukan.
h. Penentuan kadar kafein.
1. Larutan sampel yang dilarutkan dengan fase gerak methanol :
aquadest : asam asetat glasial.
 2. Larutan disaring menggunakan dengan filter holder, membran filter
(milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke system
KCKT.
i. Pengolahan dan Analisis Data.
1. Data yang diperoleh akan diolah menggunakan software pada
computer yang terhubung pada alat KCKT.
2. Sedangkan analisis data secara umum akan menggunakan Microsoft
Excel.
 BAB 3 METODE KERJA

Alat Praktikum
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah Kromatografi cair kinerja
tinggi (KCKT), Kolom C18 diameter 250 x, 6 mm, detector PDA, Neraca
analitik, filter holder, membrane filter (milllipore) 0,45 μm, Spektrofotometer
UV-VIS, Kuvet, mikropipet, alat gelas yang umum digunakan, dan labu takar.
Bahan Praktikum
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kafein pa, asetonitril
grade HPLC, aquadest, sampel berupa tablet obat sakit kepala merk X.
Cara Kerja
a. Pembuatan fase gerak standar dan fase gerak sampel.
Mencampurkan pelarut methanol : aquadest : asam asetat glasial (140
: 60 : 6), diatur hingga pH 3.
b. Pembuatan larutan standar.
Sebanyak 25 mg asam salisilat ditimbang seksama, dilarutkan dalam
fase gerak dengan komposisi methanol : aqua dest : asam asetat glasial (A)
dalam volume 10 mL. Kemudian dibuat 5 seri konsentrasi 500, 250, 100,
25, dan 2,5 ppm. Campuran dihomogenkan dan disaring dengan filter
holder, membrane filter (milllipore) 0,45 μm.
c. Pembuatan larutan sampel.
Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan dalam labu ukur 10 mL (500
ppm), kemudian diencerkan menjadi 4 seri konsentrasi lainnya
: 250, 100, 25, dan 2,5 ppm.
d. Penentuan panjang gelombang maksimum.
Larutan standar asam salisilat 2,5 ppm diukur menggunakan
Spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 200-400 nm.
e. Pengkondisian alat kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
Optimasi kondisi analisis dilakukan pada standar asam salisilat dengan
mengubah komposisi fase gerak dan laju alir yang digunakan,
menggunakan kecepatan alir 1 mL/menit. Kondisi KCKT yang digunakan
adalah kolom C18 dengan menggunakan detector PDA pada panjang
gelombang 270 nm.
f. Uji kesesuaian system.
Larutan standar asam salisilat 2,5 ppm larutan disaring menggunakan
dengan filter holder, membrane filter (milllipore) 0,45 μm, kemudian
diinjeksikan sejumlah 20 μL melalui injector ke dalam KCKT,
menggunakan kondisi optimum yang diperoleh. Hasil pengujian yang
diperoleh dicatat dan dibandingkan dengan kriteria uji kesesuaian system
antara lain yang digunakan untuk menentukan kadar penyuntikan larutan
baku, yang dinyatakan dalam waktu retensi, luas puncak, tinggi puncak,
faktor kapasitas/factor retensi, Resolusi, selektivitas, efisiensi kolom,
jumlah pelat teori (N), Jarak setara pelat teori (JSPT).
g. Validasi Metode.
1. Pembuatan kurva kalibrasi standar.
Asam Salisilat dibuat dengan konsentrasi 2,5; 25;100; 250 dan 500
ppm, larutan disaring menggunakan dengan filter holder, membrane
filter (milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke
system KCKT. Kurva kalibrasi dibuat dengan memplotkan luas area
dengan konsentrasi dari Asam Salisilat dan dihitung persamaan
regresi.
2. Uji Linearita.
Asam Salisilat konsentrasi 2,5; 25;100; 250 dan 500 ppm, larutan
disaring menggunakan dengan filter holder, membrane
 filter (milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke
system KCKT.
3. Uji batas deteksi dan batas kuantitasi.
Untuk pengujian batas deteksi dan batas kuantitasi dilakukan
berdasarkan perhitungan nilai noise dari alat KCKT yang digunkaan.
Persyaratan batas deteksi adalah tiga kali noise dan batas kuantitasi
adalah sepuluh kali noise. Kemudian dilakukan perhitungan batas
deteksi dan batas kuantitasi alat dengan menggunakan rumus sebagai
berikut :
3𝑥𝑛
BD = x konsentrasi yang diinjeksiakn
ℎ𝑎
1𝑥
BK = x konsentrasi yang di njeksikan
𝑛ℎ 𝑎
4. Uji Presisi.
Larutan uji presisi dibuat dengan cara larutan konsentrasi 2,5 ppm
larutan disaring menggunakan dengan filter holder, membrane filter
(milllipore) 0,45 μm kemudian diinjeksikan sebanyak 20μL ke system
KCKT pada kondisi yang ditentukan. Pengukuran dilakukan sebanyak
6 kali pengulangan. Kemudian hasil yang diperoleh dihitung nilai
persen simpangan baku relative (RSD).
5. Uji akurasi.
Uji akurasi dilakukan dengan menggunakan metode standar adisi.
Sampel dianalisis lalu dengan menambahkan sejumlah larutan standar
dengan konsentrasi 80%, 100% dan 120% dari kadar analit yang
diperkirakan kedalam sampel yang akan dianalisis yang dilarutkan
dengan fase gerak asetonitril : air konsentrasi 10%. larutan disaring
menggunakan dengan filter holder, membran filter (milllipore) 0,45
μm, kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke system KCKT.
Pengukuran
 dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Hasil yang diperoleh dicatat
dan dihitung persen perolehan kembali dari analit tersebut.
6. Spesifisitas.
Pengujian spesifisitas dilakukan pada larutan standar, larutan
sampel dan blanko dengan cara melihat nilai resolusi dari larutan
tersebut. Injeksikan larutan standar, larutan sampel dan larutan blanko
ke sisitem KCKT masingmasing sebanyak 20μL pada kondisi yang
ditentukan.
h. Penentuan kadar kafein.
Larutan sampel yang dilarutkan dengan fase gerak methanol :
aquadest : asam asetat glasial. Larutan disaring menggunakan dengan filter
holder, membran filter (milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan
sebanyak 20 μL ke system KCKT.
i. Pengolahan dan Analisis Data.
Data yang diperoleh akan diolah menggunakan software pada
computer yang terhubung pada alat KCKT. Sedangkan analisis data
secara umum akan menggunakan Microsoft Excel.
 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil
1. Optimasi Konsentrasi Uji dan Akurasi
No. Pengumpulan Data dan Jawaban Nilai*
Hasil
1. Eluen yang digunakan Methanol p.a :
dengan perbandingannya aquabides : asam
asetat glasial
2. - Perbandingan eluen 140 : 60 : 6
yang dibuat
- pH eluen yang terukur pH 3
- Hal yang perlu Saring eluen terlebih
dilakukan sebelum dahulu
eluen digunakan
- Diletakkan pada pompa Pompa D
- Laju alir 1 mL/menit
- Waktu analisis 5 menit
- Waktu baseline stabil 15 menit
3. - Bahan standar Asam salisilat
- Variasi Konsentrasi 1) 2,5 ppm
Standar (ppm) 2) 25 ppm
3) 100 ppm
4) 250 ppm
5) 500 ppm
- Berat yang ditimbang 0,025 gr atau 25 mg
4. - Sampel Clean and clear
- Variasi Konsentrasi 1) 2,5 ppm
Sampel (ppm) 2) 25 ppm
 3) 100 ppm
4) 250 ppm
5) 500 ppm
- Volume sampel yang 1 mL
digunakan
5. Yang perlu diperhatikan Tidak terbentuk
pada saat pengambilan gelembung pada
sampel dengan syringe syringe injektor
injektor
6. Respon detektor (efisiensi Nilai Resolusi (R)
Kromatogram) Nilai teoritikal plat (N)
Nilai HETP (H)
7. Hasil Akurasi
1. 79,01 %
2. 87,954 %
3. 107,084 %
4. 117,56 %
8. Hasil konsentasi optimal i. m

2. Linieritas
No. Pengumpulan Data dan Jawaban Nilai*
Hasil
1. - Eluen yang digunakan Methanol : aquabides :
asam asetat galasial
- Kegunaannya Sebagai pelarut dan
fase gerak
2. - Perbandinagn eluen 210 : 90 : 9
yang dibuat
- pH eluen yang terukur pH 3
 - Hal yang perlu
dilakukan sebelum
eluen digunakan
- Diletakkan pada pompa
3. - Bahan standar
- Range larutan standar
- Kosentrasi larutan uji
yang dipilih
- Variasi Konsentrasi
Standar (ppm)
- Berat yang ditimbang
pertama
- Untuk kosentrasi
- Berat yang ditimbang
kedua
- Untuk konsetrasi
- Standar yang sudah dibuat
selanjutkan harus
diapakan sebelum
digunakan
Eluen disaring terlebih
dahulu
Pompa D
Asam salisilat
10%-200%
100 ppm
10, 20, 40, 60, 80, 100,
120, 160, 180, dan 200
ppm
0,051 gram
5000 ppm
0,0253 gram
2500 ppm
Dilarutkan larutan asam
salisilat menggunakan
pelarut (eluen) yang
telah di cek pH nya
dalam labu ukur 10 ml
dan kaitkan sampai
tanda batas, dan
dilakukan pengenceran
sebanyak 1 ml pada
konsentrasi 5000 ppm
dan diencerkan sampe
200 ppm dan dilarutkan
kembali menggunakan
eluen begitupun dengan
standar konsentrasi
2500 ppm sebanyak 1
ml dan diencerkan
menjadi konsentrasi 300
ppm dalam labu ukur 25
ml yang dilarutkan
menggunakan
pelarut/eluen.
Selanjutnya dilakukan
pengenceran untuk
konsentrasi 300 ppm
sebanyak 2 ml
menjadi 60 ppm
dimasukkand alam labu
ukur 10 ml kemudian
dilarutkan dengan eluen
sampaii tanda batas,
setelah itu dimasukkan
kedalam labu ukur 10
ml untuk pengenceran
konsentrasi 10
ppm kemudian
dilarutkan kembali
 dengan eluen. Standar
yang sudah diencerkan
kemudian
disaring.
4. Parameter validasi Koefisien relasi (r),
linieritas VX0, dan Fanova
5. Kriteria keberterimaan r
= > 0,99
Vx0= 0% hingga 5 %
6. Hasil yang didapat r
= 0,99962740
Vx0= 2,53369500%
7. Kesimpulan Memenuhi persyaratan

3. LOD dan LOQ

No. Pengumpulan Data dan Jawaban Nilai*
Hasil
1. - Eluen yang digunakan Methanol : aquabidest
: asam asetat glasial
2. - Perbandinagn eluen 210 : 90 : 9
yang dibuat
- pH eluen yang terukur pH 3
- Hal yang perlu Eluen disaring terlebih
dilakukan sebelum dahulu
eluen digunakan
- Diletakkan pada pompa Pompa D
3. - Bahan standar Asam salisilat
- Jumlah variasi 10 variasi konsentrasi
 konsentrasi
- Penentuan variasi Dibawah konsentrasi
Konsentrasi terkecil linieritas (10
ppm)
- Standar (ppm)variasi 1,0; 2,0; 3,0; 4,0, 5,0;
konsentrasi 6,0; 7,5; 8,0; 9,0; dan
10,0 ppm
- Berat yang ditimbang 0,05 gram atau 50 mg
pertama
- Untuk kosentrasi 5000 ppm
- Berat yang ditimbang 0,025 gram atau 25
kedua mg
- Untuk konsetrasi 2500 ppm
- Standard yg sdh dibuat Diencerkan kemudian
selanjutkan harus dilakukan penyaringan
diapakan sebelum
digunakn
4. Respon detektor yang Luas area puncak
diamati
5. Jumlah titik konsentrasi 6
yang digunakan pada
kurva linier
6. Jumlah titik konsentrasi 4
yang tidak digunakan
pada kurva linier
7. Luas area masing-2
konsentrasi (ppm) yang
digunakan
1. 1 1. 52
 2. 2 2. 98,4
3. 4 3. 172,3
4. 5 4. 214,8
5. 8 5. 352,6
6. 10 6. 425,1
8. Persamaan regresi Y= 41,79667000x +
10,21665000
9. Kriteria keberterimaan r
= >0,99
Vx0= 0% hingga 5%
10. Hasil yang didapat r
= 0,99933210
Vx0= 2,83229600%
11. Kesimpulan Memenuhi persyaratan

4. Presisi dan Selektifitas

No. Pengumpulan Data dan Jawaban Nilai*
Hasil
1. Eluen yang digunakan Methanol : Asam
Asetat Glasial :
Aquabidest
2. Perbandinagn eluen 210 : 9 : 90
yang dibuat
pH eluen yang terukur pH 3
Hal yang perlu Eluen disaring terlebih
dilakukan sebelum dahulu
eluen digunakan
Diletakkan pada pompa Pompa D
3. Bahan standar Standar asam
 salisilat
Berat yang ditimbang 1. 0,0503 gram
2. 0,0253 gram
Untuk kosentrasi 1. 5000 ppm
2. 2500 ppm
4. Respon detektor yang Luas area puncak dan
diamati spectra
5. Konsentrasi (ppm) yang 60, 80, 100, 120, 140
digunakan dan 160 ppm
6. Jumlah pengukuran 6 kali replikasi
larutan (replikasi)
7. Luas area dari masing-
masing pengukuran
larutan
1. 1 1. 52
2. 2 2. 98,43
3. 4 3. 172,3
4. 5 4. 214,8
5. 8 5. 352,6
6. 10 6. 425,1
8. Kriteria keberterimaan 0 % hingga 5 %
9. Hasil yang didapat
RSD = 0,4905 %
0,4673 %
0,4889 %
10. Kesimpulan Memenuhi
persyaratan
5. Penentuan Kadar
No. Pencatatan dan Jawaban Nilai*
Pelaporan
1. Konsentrasi 2,5 ppm
larutan uji yang 25 ppm
diukur 100 ppm
250 ppm
500 ppm
2. Data luas area dari
pengukuran larutan
uji
1. 1. 2387,5
2. 2. 2504,1
3. 3. 2495,91
3. Perhitungan 1. % kadar = 0,004905 x 100 %
1 𝑚𝐿
Penentuan Kadar
= 0,4905 %

2. % kadar = 0,004673
x 100%
1 𝑚𝐿

= 0,4673 %
3. % kadar = 0,004889
x 100%
1 𝑚𝐿

= 0,4889 %
4. Kadar yang 0,4905%
diperoleh 0,4673%
0,4889%
5. Kesimpulan Memenuhi persyaratan
6. Kesimpulan Memenuhi persyaratan
metode validasi parameter validasi pada
dari hasil Farmakope Indonesia
 pengukuran

Pembahasan
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.
Validasi metode analisis bertujuan untuk mengkonfirmasi bahwa metode
analisis tersebut dapat sesuai untuk peruntukannya. Validasi metode analisis
juga merupakan proses yang dilakukan melalui percobaan laboratorium
dimana karakteristik dari suatu prosedur memenuhi persyaratan untuk
aplikasi analisis.
Kromatografi Cair Berferoma Tinggi (KCKT) atau dalam bahasa
inggrisnya yaitu Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya
disertai dengan tekanan tinggi. HPLC berupaya untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan afinitas selektif antara fase diam terntentu dan fase
gerak tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat
padat.
Pada percobaan kali ini, dilakukan pengujian validasi metode penentuan
kadar asam salisilaat pada sampel (Clean and Clear) menggunakan metode
HPLC. Terdapat beberapa pengujian yaitu uji Pembuatan fase gerak standar
dan fase gerak sampel, pembuatan larutan standar, pembuatan larutan sampel,
penentuan panjang gelombang maksimum, pengkondisian alat KCKT, uji
kesesuaian sistem dan validasi metode. Validasi metode sendiri terdiri uji
pembuatan kurva kalibrasi standar dan pengujian pada beberapa parameter,
diantaranya yaitu linearitas, batas deteksi dan batas kuantitas, presisi, akurasi,
dan spesifitas, serta dihitung juga kadar kafein.
 Pada pengujian perrtama dilakukan pengujian akurasi. Akurasi adalah
ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit
yang sebenar. Uji ini dilakukan dengan cara menyiapkan larutan standar dan
juga larutan sampel pada 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 2,5; 25; 100; 250;
dan 500 ppm. Dibuatkan juga eluen dengan perbandingan tertentu. Kemudian
didapatkan hasil akurasi yaitu 79,07%, 87,954%, 107,084%, dan 117,96%.
Adapun hasil yang diperoleh konsentrasi optimal adalah 100 ppm.
Selanjutnya dilakukan uji linearitas. Linieritas menunjukkan kemampuan
suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan
konsentrasi analit yang terdapat pada sampel pada kisaran konsentrasi
tertentu. Uji ini dilakukan dengan cara membuat 10 larutan standar dengan
konsentrasi diantara 10-200 ppm dan digunakan konsentrasi 100 ppm senagai
larutan uji kemudian dianalisis menggunakan HPLC. Adapun kriteria
keberterimaan untuk nilai r yaitu > 0,99 dan Vxo yaitu 0% hingga 5%. Hasil
yang di peroleh adalah nilai r yaitu 0,99962740 dan Vxo yaitu 2,53369500%..
Ini menunjukkan bahwa metode telah memenuhi syarat kriteria keberterimaan
dari parameter linearitas
Selanjutnya dilakukan uji Batas Kuantitasi (LOQ) dan Batas Deteksi
(LOD). Limit kuantitasi (LOQ) merupakan jumlah analit terkecil dalam
sampel yang masih dapat diukur dengan akurat dan presisi oleh
alat/instrument. limit deteksi (LOD) adalah konsentrasi atau jumlah
terkecil/terendah dari analit dalam sampel yang masih menunjukkan nilai
serapan atau absorbansi pada alat. Uji ini dilakukan dengan cara menyiapkan
larutan standar dengan konsentrasi dibawah konstrasi terkecil pada linearitas
yaitu 10 ppm. Diambil juga 10 konsentrasi lain seperti 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0;
6,0; 7,5; 8; 9; 10 ppm. Analisis
menggunakan HPLC yang bertujuan untuk menentukan luas daerah puncak
pada setiap sampel. Kemudian dihitung LOQ dan LOD, masukkan data yang
diperoleh menjadi persamaan regresi lalu pastikan koefisien korelasinya.
Kriteria keberterimaan untuk nilai r yaitu > 0,99 dan Vxo yaitu 0% hingga
5%. Adapun hasil yang di peroleh adalah nilai r yaitu 0,99933210 dan Vxo
yaitu 2,83229600%, ini menunjukkan bahwa metode telah memenuhi syarat
kriteria keberterimaan dari parameter Batas Kuantitasi (LOQ) dan Batas
Deteksi (LOD).
Selanjutnya dilakukan uji presisi dan selektivitas. Presisi adalah ukuran
kedekatan hasil analisis diperoleh dari serangkaian pengukuran ulangan dari
ukuran yang sama. Selektivitas (spesifitas) adalah kemampuan yang hanya
mengukur zat tertentu saja secara seksama dengan adanya komponen lain
yang mungkin ada dalam matriks sampel. Uji ini dilakukan dengan cara
menyiapkan larutan standar dengan 6 konsentrasi yang berada disekitar 100
ppm yaitu 60, 80, 100, 120, 140, dan 160 ppm serta dilakukan 6 replikasi.
Respon detektor yang dilihat adalah luas area puncak dan spektra dalam
menentukan nilai RSD. Caranya yaitu analisis dengan metode HPLC sehingga
didapat luas area puncak dan spektra. Kriteria keberterimaan 0% hingga 5%.
Adapun hasil uji yang diperoleh untuk nilai RSD yaitu 0,4905 %, 0,4673 %,
0,4889 %. Ini menunjukkan bahwa metode telah memenuhi syarat kriteria
keberterimaan dari parameter presisi dan selektifitas.
Uji yang terakhir yaitu penentuan kadar konsentrasi larutan uji yang
diukur pada 2,5 ppm, 25 ppm, 100 ppm, 250 ppm, dan 500 ppm. Adapun data
luas area dari pengukuran yang didapat yaitu 2387,5, luas area 2 yaitu 2404,1,
dan luas area 3 yaitu 2495,91. Dari hasil perhitungan % kadar di peroleh
hasil untuk % kadar ke-1 yaitu
0,4905%, % kadar ke-2 yaitu 0,4673% dan % kadar yang ke-3 yaitu 0,4889%.
Ini menunjukkan bahwa metode telah memenuhi syarat keberterimaan dari
parameter validasi sesuai dengan Farmakope Indonesia.
 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang didapat dari praktikum Validasi Metode
Penentuan Kadar Asam Salisilat pada Sampel (Clean and Clear)
Menggunakan Metode HPLC adalah pada setiap pengujian memiliki tujuan
masing-masing dan juga prosedur pengujian yang berbeda. Pada Validasi,
terdapat parameter yang perlu diuji dan dan perlu dipastikan bahwa metode
HPLC telah memeuhi syarat untuk digunakan. Validasi metode sendiri
memiliki beberapa parameter uji yang dilakukan agar suatu metode dapat
dikatan tervalidasi antara lain, yaitu akurasi, linearitas dan rentang, batas
kuantitasi (LOQ) dan batas deteksi (LOD), presisi, dan juga selektifitas
Hasil yang didapat yaitu, pada pengujian akurasi, konsentrasi optimal
yaiitu 100 ppm. Pada uji linearitas dan rentang, hasil yang didapat yaitu r
0,99962740 dan Vxo yaitu 2,53369500%. Pada uji batas kuantitas dan batas
deteksi, hasil yang didapat adalah r yaitu 0,99933210 dan Vxo yaitu
2,83229600%. Pada uji presisi dan selektifitas, hasil yang didapat yaitu
adalah nilai RSD yaitu 0,4905 %, 0,4673 %, 0,4889 %. Pada penentuan kadar
konsentrasi larutan, hasil yang didapat adalah untuk % kadar ke-1 yaitu
0,4905%, % kadar ke-2 yaitu 0,4673% dan % kadar yang ke-3 yaitu
0,4889%. Dari beberapa pengujian parameter yang dilakukan, maka dapat
disimpulkan bahwa memenuhi syarat keberterimaan dan telah memenuhi
persyaratan paramter validasi pada Farmakope Indonesia
Saran
Adapun kesimpulan yang didapat berdasarkan praktikum ini yaitu
praktikan harus memperhatikan asisten dengan baik sehingga tidak terjadi
kesalahan dalam melakukan prosedur kerja.
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2021., Penuntun Praktikum Analisis Instrumen, Fakultas Farmasi,

Universitas Muslim Indonesia, Makassar.

Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age International
(p) Ltd.

David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw- Hill

De Lux Putra, Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Farmasi Jurnal, hlm. 5-8.

Gandjar, I.G., & Rohman, A., 2012, Analisis Obat Secara Spektrofotometri dan
Kromatografi, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Ditjen POM, 1979,Farmakope Indonesia Edisi III, Deperteman Kesehatan

RepubIik ndonesia: Jakarta

Rohman, A., 2009, Analisis Obat, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
 LAMPIRAN
LEMBAR KERJA DAN RUBRIK
PERCOBAAN II
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR ASAM SALISILAT PADA
SAMPEL (CLEAN AND CLEAR) MENGGUNAKAN METODE HPLC

NAMA : IZZATUL FIKRIL MUJTAHID

STB 15020200216
KELAS :
C11AC12A
KELOMPOK : 2 (DUA)
NILAI :

1. Optimasi Konsentrasi Uji dan Akurasi

No. Pengumpulan Data dan Hasil Jawaban Nilai*
1. Eluen yang digunakan Methanol p.a :
dengan perbandingannya aquabides : asam
asetat glasial
2. - Perbandingan eluen yang 140 : 60 : 6
dibuat
- pH eluen yang terukur pH 3
- Hal yang perlu dilakukan Saring eluen terlebih
sebelum eluen digunakan dahulu
- Diletakkan pada pompa Pompa D
- Laju alir 1 mL/menit
- Waktu analisis 5 menit
- Waktu baseline stabil 15 menit
3. - Bahan standar Asam salisilat
- Variasi Konsentrasi 1) 2,5 ppm
Standar (ppm) 2) 25 ppm
3) 100 ppm
4) 250 ppm
5) 500 ppm
 - Berat yang ditimbang 0,025 gr atau 25 mg
4. - Sampel Clean and clear
- Variasi Konsentrasi Sampel 1) 2,5 ppm
(ppm) 2) 25 ppm
3) 100 ppm
4) 250 ppm
5) 500 ppm
- Volume sampel yang 1 mL
digunakan
5. Yang perlu diperhatikan pada Tidak terbentuk
saat pengambilan sampel gelembung pada
dengan syringe injektor syringe injektor
6. Respon detektor (efisiensi Nilai Resolusi (R)
Kromatogram) Nilai teoritikal plat (N)
Nilai HETP (H)
7. Hasil Akurasi
1. 79,01 %
2. 87,954 %
3. 107,084 %
4. 117,56 %
8. Hasil konsentasi optimal 100m

2. Linieritas
No. Pengumpulan Data dan Hasil Jawaban Nilai*
1. - Eluen yang digunakan Methanol : aquabides :
asam asetat galasial
- Kegunaannya Sebagai pelarut dan
fase gerak
2. - Perbandinagn eluen yang 210 : 90 : 9
 Dibuat
- pH eluen yang terukur
- Hal yang perlu dilakukan
sebelum eluen digunakan
- Diletakkan pada pompa
3. - Bahan standar
- Range larutan standar
- Kosentrasi larutan uji yang
Dipilih
- Variasi Konsentrasi
Standar (ppm)
- Berat yang ditimbang
Pertama
- Untuk kosentrasi
- Berat yang ditimbang
Kedua
- Untuk konsetrasi
- Standar yang sudah dibuat
selanjutkan harus diapakan
sebelum digunakan
pH 3
Eluen disaring terlebih
dahulu
Pompa D
Asam salisilat
10%-200%
100 ppm
10, 20, 40, 60, 80, 100,
120, 160, 180, dan 200
ppm
0,051 gram
5000 ppm
0,0253 gram
2500 ppm
Dilarutkan larutan asam
salisilat menggunakan
pelarut (eluen) yang
telah di cek pH nya
dalam labu ukur 10 ml
dan kaitkan sampai
tanda batas, dan
dilakukan pengenceran
sebanyak 1 ml pada
konsentrasi 5000 ppm
 dan diencerkan sampe
200 ppm dan dilarutkan
kembali menggunakan
eluen begitupun dengan
standar konsentrasi 2500
ppm sebanyak 1 ml dan
diencerkan menjadi
konsentrasi 300 ppm
dalam labu ukur 25 ml
yang dilarutkan
menggunakan
pelarut/eluen.
Selanjutnya dilakukan
pengenceran untuk
konsentrasi 300 ppm
sebanyak 2 ml
menjadi 60 ppm
dimasukkand alam labu
ukur 10 ml kemudian
dilarutkan dengan eluen
sampaii tanda batas,
setelah itu dimasukkan
kedalam labu ukur 10
ml untuk pengenceran
konsentrasi 10
ppm kemudian
 dilarutkan kembali
dengan eluen. Standar
yang sudah diencerkan
kemudian
disaring.
4. Parameter validasi linieritas Koefisien relasi (r),
VX0, dan Fanova
5. Kriteria keberterimaan r
= > 0,99
Vx0= 0% hingga 5 %
6. Hasil yang didapat r
= 0,99962740
Vx0= 2,53369500%
7. Kesimpulan Memenuhi persyaratan

3. LOD dan LOQ

No. Pengumpulan Data dan Hasil Jawaban Nilai*
1. - Eluen yang digunakan Methanol : aquabidest
: asam asetat glasial
2. - Perbandinagn eluen yang 210 : 90 : 9
dibuat
- pH eluen yang terukur pH 3
- Hal yang perlu dilakukan Eluen disaring terlebih
sebelum eluen digunakan dahulu
- Diletakkan pada pompa Pompa D
3. - Bahan standar Asam salisilat
- Jumlah variasi konsentrasi 10 variasi konsentrasi
- Penentuan variasi Dibawah konsentrasi
Konsentrasi terkecil linieritas (10
 ppm)
- Standar (ppm)variasi 1,0; 2,0; 3,0; 4,0, 5,0;
konsentrasi 6,0; 7,5; 8,0; 9,0; dan
10,0 ppm
- Berat yang ditimbang 0,05 gram atau 50 mg
Pertama
- Untuk kosentrasi 5000 ppm
- Berat yang ditimbang 0,025 gram atau 25
Kedua mg
- Untuk konsetrasi 2500 ppm
- Standard yg sdh dibuat Diencerkan kemudian
selanjutkan harus diapakan dilakukan penyaringan
sebelum digunakn
4. Respon detektor yang Luas area puncak
Diamati
5. Jumlah titik konsentrasi yang 6
digunakan pada kurva linier
6. Jumlah titik konsentrasi yang 4
tidak digunakan pada kurva
linier
7. Luas area masing-2
konsentrasi (ppm) yang
digunakan
1. 1 1. 52
2. 2 2. 98,4
3. 4 3. 172,3
4. 5 4. 214,8
5. 8 5. 352,6
6. 10 6. 425,1
 8. Persamaan regresi Y= 41,79667000x +
10,21665000
9. Kriteria keberterimaan r
= >0,99
Vx0= 0% hingga 5%
10. Hasil yang didapat r
= 0,99933210
Vx0 = 2.83229600%
11. Kesimpulan Memenuhi persyaratan

4. Presisi dan Selektifitas

No. Pengumpulan Data dan Jawaban Nilai*
Hasil
1. Eluen yang digunakan Methanol : Asam
Asetat Glasial :
Aquabidest
2. Perbandinagn eluen yang 210 : 9 : 90
dibuat
pH eluen yang terukur pH 3
Hal yang perlu dilakukan Eluen disaring terlebih
sebelum eluen digunakan dahulu
Diletakkan pada pompa Pompa D
3. Bahan standar Standar asam
salisilat
Berat yang ditimbang 1. 0,0503 gram
2. 0,0253 gram
Untuk kosentrasi 1. 5000 ppm
2. 2500 ppm
 4. Respon detektor yang Luas area puncak dan
diamati spectra
5. Konsentrasi (ppm) yang 60, 80, 100, 120, 140
digunakan dan 160 ppm
6. Jumlah pengukuran larutan 6 kali replikasi
(replikasi)
7. Luas area dari masing-
masing pengukuran larutan 1.
1 1. 52
2. 2 2. 98,43
3. 4 3. 172,3
4. 5 4. 214,8
5. 8 5. 352,6
6. 10 6. 425,1
8. Kriteria keberterimaan 0 % hingga 5 %
9. Hasil yang didapat
RSD = 0,4905 %
0,4673 %
0,4889 %
10. Kesimpulan Memenuhi
persyaratan

5. Penentuan Kadar
No. Pencatatan dan Jawaban Nilai
Pelaporan *
1. Konsentrasi larutan 2,5 ppm
uji yang diukur 25 ppm
100 ppm
250 ppm
 500 ppm
2. Data luas area dari
pengukuran larutan
uji
1. 1. 2387,5
2. 2. 2504,1
3. 3. 495,91
3. Perhitungan 1. % kadar = 0,004905 x 100 %
1 𝑚𝐿
Penentuan Kadar
= 0,4905 %
6. % kadar = 0,004673
x 100%
1 𝑚𝐿

= 0,4673 %
7. % kadar = 0,004889
x 100%
1 𝑚𝐿

= 0,4889 %
4. Kadar yang diperoleh 0,4905%
0,4673%
0,4889%
5. Kesimpulan Memenuhi persyaratan
6. Kesimpulan metode Memenuhi persyaratan
validasi dari hasil parameter validasi pada
pengukuran Farmakope Indonesia

Makassar, 07-10-2021

Izzatul Fikril Mujtahid

 SKEMA KERJA
Pembuatan fase gerak standar dan fase gerak sampel.
Mencampurkan pelarut methanol : aquadest : asam asetat glasial (140 : 60 : 6),
diatur hingga pH 3.

Pembuatan larutan standar.
Sebanyak 25 mg asam salisilat ditimbang seksama, dilarutkan dalam fase gerak
dengan komposisi methanol : aqua dest : asam asetat glasial (A) dalam volume 10
mL. Kemudian dibuat 5 seri konsentrasi 500, 250, 100, 25, dan 2,5 ppm.
Campuran dihomogenkan dan disaring dengan filter holder, membrane filter
(milllipore) 0,45 μm.

Pembuatan larutan sampel.
Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan dalam labu ukur 10 mL (500 ppm),
kemudian diencerkan menjadi 4 seri konsentrasi lainnya : 250, 100, 25,
dan 2,5 ppm.

Penentuan panjang gelombang maksimum.
Larutan standar asam salisilat 2,5 ppm diukur menggunakan
Spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 200-400 nm.

Pengkondisian alat kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
Optimasi kondisi analisis dilakukan pada standar asam salisilat dengan
mengubah komposisi fase gerak dan laju alir yang digunakan, menggunakan
kecepatan alir 1 mL/menit. Kondisi KCKT yang digunakan adalah kolom C18
dengan menggunakan detector PDA pada panjang gelombang 270 nm.

 Uji kesesuaian system.
Larutan standar asam salisilat 2,5 ppm larutan disaring menggunakan dengan
filter holder, membrane filter (milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan
sejumlah 20 μL melalui injector ke dalam KCKT, menggunakan kondisi
optimum yang diperoleh. Hasil pengujian yang diperoleh dicatat dan
dibandingkan dengan kriteria uji kesesuaian system antara lain yang digunakan
untuk menentukan kadar penyuntikan larutan baku, yang dinyatakan dalam
waktu retensi, luas puncak, tinggi puncak, faktor kapasitas/factor retensi,
Resolusi, selektivitas, efisiensi kolom, jumlah pelat teori (N), Jarak setara pelat
teori (JSPT).

Validasi Metode.
Pembuatan kurva kalibrasi standar.
Asam Salisilat dibuat dengan konsentrasi 2,5; 25;100; 250 dan 500 ppm, larutan
disaring menggunakan dengan filter holder, membrane filter (milllipore) 0,45
μm, kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke system KCKT. Kurva kalibrasi
dibuat dengan memplotkan luas area dengan konsentrasi dari Asam Salisilat dan
dihitung persamaan regresi.

Uji Linearita.
Asam Salisilat konsentrasi 2,5; 25;100; 250 dan 500 ppm, larutan disaring
menggunakan dengan filter holder, membrane filter (milllipore) 0,45 μm,
kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke system KCKT.

Uji batas deteksi dan batas kuantitasi.
Untuk pengujian batas deteksi dan batas kuantitasi dilakukan berdasarkan
perhitungan nilai noise dari alat KCKT yang digunkaan. Persyaratan batas deteksi
adalah tiga kali noise dan batas kuantitasi adalah sepuluh kali
noise. Kemudian dilakukan perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi alat
dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
3𝑥𝑛
BD = x konsentrasi yang diinjeksiakn
ℎ𝑎
1𝑥
BK = x konsentrasi yang di njeksikan
𝑛ℎ 𝑎


Uji Presisi.
Larutan uji presisi dibuat dengan cara larutan konsentrasi 2,5 ppm larutan
disaring menggunakan dengan filter holder, membrane filter (milllipore) 0,45 μm
kemudian diinjeksikan sebanyak 20μL ke system KCKT pada kondisi yang
ditentukan. Pengukuran dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan. Kemudian hasil
yang diperoleh dihitung nilai persen simpangan baku relative (RSD).

Uji akurasi.
Uji akurasi dilakukan dengan menggunakan metode standar adisi. Sampel
dianalisis lalu dengan menambahkan sejumlah larutan standar dengan konsentrasi
80%, 100% dan 120% dari kadar analit yang diperkirakan kedalam sampel yang
akan dianalisis yang dilarutkan dengan fase gerak asetonitril : air konsentrasi
10%. larutan disaring menggunakan dengan filter holder, membran filter
(milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke system KCKT.
Pengukuran dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Hasil yang diperoleh dicatat
dan dihitung persen perolehan kembali dari analit tersebut.


Spesifisitas.
Pengujian spesifisitas dilakukan pada larutan standar, larutan sampel dan blanko
dengan cara melihat nilai resolusi dari larutan tersebut. Injeksikan larutan standar,
larutan sampel dan larutan blanko ke sisitem KCKT masingmasing sebanyak
20μL pada kondisi yang ditentukan.

Penentuan kadar kafein.
Larutan sampel yang dilarutkan dengan fase gerak methanol : aquadest : asam
asetat glasial. Larutan disaring menggunakan dengan filter holder, membran filter
(milllipore) 0,45 μm, kemudian diinjeksikan sebanyak 20 μL ke system KCKT.

Pengolahan dan Analisis Data.
Data yang diperoleh akan diolah menggunakan software pada computer yang
terhubung pada alat KCKT. Sedangkan analisis data secara umum akan
menggunakan Microsoft Excel.