LABORATORIUM KIMIA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

LAPORAN PRAKTIKUM

KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

OLEH :

NAMA : TAMAR SAMAWATI A

STAMBUK : 15020180177

KELAS : C9C10

KELOMPOK :2

ASISTEN : RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

MAKASSAR

2020
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Analisis Instrumen merupakan salah satu cabang ilmu kimia
yang mempelajari tentang analisis secara kualitatif ataupun kuantitatif
dari bahan-bahan yang mengandung senyawa kimia contohnya
seperti obat-obatan, kosmetik, hingga bahan makanan atau minuman
yang dikonsumsi manusia.
Dalam menganalisis suatu sampel, dibutuhkan suatu alat atau
instrument tertentu serta metode yang sesuai. Salah satu contohnya
yaitu HPLC atau High Performance Liquid Chromatography. Dalam
penggunaannya, terlebih dahulu dilakukan proses verifikasi yang
bertujuan untuk memastikan alat yang digunakan sudah sesuai atau
tidak. Proses verifikasi ini biasa disebut kalibrasi.
Kalibrasi merupakan proses untuk menyesuaikan kebenaran
dari nilai-nilai yang ditunjukkan oleh alat atau instrumen dengan
membandingkannya dengan nilai standar yang digunakan dalam
akurasi tertentu. Kalibrasi sudah menjadi syarat atau ketentuan bahwa
setiap alat ukur yang ingin digunakan harus dikalibrasi terlebih dahulu
agar data yang nantinya diperoleh tidak salah dan sesuai dengan data
standar yang sudah ditetapkan.
Kromatografi merupakan teknik pemisahan molecular yang
didasarkan pemisahan pada pola gerakan yang berbeda antara fase
diam dan fase geraknya. Prinsip kromatografi yaitu adsorpsi dan
partisi dimana fase gerak dapat berupa gas atau cair dan fase diam
dapat berupa cair atau padatan.
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau dikenal juga HPLC
merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik
kromatografi dimana fase geraknya berupa cairan dan fase diamnya
dapat berupa cairan ataupun padatan.

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

1.2 Maksud Praktikum

Adapun maksud percobaan ini diharapkan mahasiswa mampu
1. Memahami prinsip kegunaan kalibrasi
2. Menjelaskan cara melakukan kalibrasi KCKT
1.3 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan pada percobaan ini adalah untuk mempraktekkan
bagaimana cara melakukan kalibrasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
 KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori Umum

Menurut ISO / IEC Guide 17025 : 2005 dan vocabulary of
international metodologi, kalibrasi adalah kegiatan yang
menghubungkan nilai yang ditunjukkan oleh instrumen ukur atau nilai
yang diwakili oleh bahan ukur dengan  nilai yang sudah diketahui
tingkat kebenarannya (yang berkaitan dengan kisaran yang diukur).
Kalibrasi yang biasa dilakukan dengan membandingkan suatu
standarisasi (ISO, 2005).
Kalibrasi pada umumnya merupakan proses untuk
menyesuaikan keluaran atau nidikasi dari suatu perangkat
pengukuran agar sesuai dengan besaran dari standar yang digunakan
dalam akurasi tertentu. Contohnya, thermometer dapat ditentukan dan
disesuaikan, sehingga thermometer tersebut menunjukkan
temperature yang sebenarnya dalam celcius pada titik- titik tertentu di
skala (Hadi, 2005).
Tujuan kalibrasi adalah menentukan deviasa atau
penyimpangan kebenaran nilai konvensional penunkukkan suatu
instrumen ukur, menjamin hasil-hasil pengukuran sesuai dengan
standar nasional maupun internasional. Manfaat kalibrasi ini adalah
menjaga kondisi instrumen ukur dan bahan ukur agar tetap sesuai
dengan spesifikasinya (Fatimah, 2003).
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan
unsur unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa,
satu dari fasa fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas
permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang
merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa
stasioner/diam dapat berupa zat padat atau cairan, dan fasa gerak
dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan : cair-padat, gas-

padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 2002).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga
disebut dengan HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy )
dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an.
Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara
luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan,
bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan (Rohman, 2013).
Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak air dialirkan dengan
pompa melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkanke datigum
aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuatan
interaksi antara salut-salut terhadap fase diam akan keluar dari kolom
lebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen campuran yang keluar
dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram (Lestari, 2014).
Beberapa kelebihan yang dimiliki kromatografi HPLC sehingga
menjadikannya sebagai “the best choice” dalam dunia
penentuan/pemisahan ion/logam, di antaranya (Ardianingsih, 2009) :
a. Kecepatan (speed)
Kecepatan dalam analisis suatu sampel menjadi aspek yang
sangat penting dalam hal analisis ion yaitu untuk mengurangi biaya,
bisa mengahsilkan data analisis yang akurat dan cepat dan bisa
mengurangi limbah (waste) yang dihasilkan dari penggunaan eluen.
b. Sensitivitas (sensitivity)
Perkembangan rehnologi mikro prosessor yang dikombinasikan
dengan efisiensi kolom pemisah, mulai ukuran diameter dalam
milimeter sampai skala mikro yang biasa juga disebut microcolumn,
membuat pendeteksian ion dalam sampel menjadi lebih baik,

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

meskipun jumlah sampel yang diinjeksikan ke dalam kolom

pemisah sangat sedikit.
c. Selektivitas (selectivity)
Dengan sistem ini, bisa dilakukan pemisahan berdasarkan
keinginan, misalnya kation/anion organik saja atau kation/anion
anorganik yang ingin dipisahkan. Itu dapat dilakukan dengan
memilih kolom pemisah yang tepat.
d. Pendeteksian yang serempak (simultaneous detection)
Teknik pendeteksian sekali injeksi untuk sebuah sampel seperti
ini penting untuk dilakukan karena tentunya mempunyai sejumlah
kelebihan dibanding pemisahan terpisah. Sebagaimana telah diulas
diatas, beberapa kelebihan di antaranya dapat menekan biaya
operasional, memperkecil jumlah limbah saat analisis (short time
analysis) serta dapat memaksimalkan hasil yang diinginkan.
e. Kestabilan pada kolom pemisah (stability of the separator column)
Walaupun sebenarnya, ketahanan kolom ini berdasarkan pada
paking (packing) material yang diidikan ke dalam kolom pemsiah
bisa bertahan pada perubahan yang terjadi pada sampel, misalnya
konsentrasi suatu ion terlalu tinggi, tidak akan mempengaruhi
kestanilan material penyusun kolom pemisah yang mempunyai
waktu penggunaan yang tidak terlalu lama, dikarenakan kemasan
kolom yang kurang baik atau karena faktor internal lainnya.
2.2 Uraian Bahan
1. Aquadest (Ditjen POM 2020: 69)
Nama Resmi : Purified water
Nama Lain : Air murni
Rumus Molekul : H2O
Rumus Struktur :H–O–H
Berat Molekul : 18,02 g/mol
Pemerian : Cairan tidak berwarna, tidak berbau

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Penyimpanan : Jika dikemas, gunakan kemasan wadah non

reaktif yang dirancang untuk mencegah
masuknya mikroba.
2. Kofein (Ditjen POM 2020: 955)
Nama Resmi : CAFFEINE
Nama Lain : Kafein
Rumus Molekul : C8H10N4O2
Rumus Struktur :

Berat Molekul : 194,19 g/mol

Pemerian : Serbuk putih, bentuk jarum mengkilat,
biasanya menggumpal; tidak berbu; rasa
pahit; larutan bersifat netral terhadap kertas
lakmus; bentuk hidratnya mengembang di
udara.
Kelarutan : Agak sukar larut dalam air dan dalam etanol;
mudah larut dalam kloroform; sukar larut
dalam eter.
Penyimpanan : Dalam wadah dosis tunggal, dari kaca Tipe 1,
terututup rapat. Simpan pada suhu antara 15 O
dan 30O.
3. Metanol (Ditjen POM, 1979: 706)
Nama Resmi : METANOL
Nama Lain : Metanol
Berat Molekul : 32 g/mol
Rumus Molekul : CH3OH
Rumus Struktur :

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
 KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, bau khas

Kelarutan : Dapat bercampur dengan air, membentuk
cairan jernih, tidak berwarna
Penyimpanan : Dalam wah tertutup rapat
2.3 Prosedur Kerja (Anonim 2020: 12-15)
Langkah-langkah dalam melakukan Kalibrasi HPLC.
1. Preparasi larutan baku Caffein
Sebelum dilakukan kalibrasi dibuat dahulu Larutan Caffein
Induk 250 ppm/ 50 mL, kemudian dari larutan induk diencerkan
dibuat seri konsentrasi 10, 15, 20, 25 dan 30 ppm masing-masing
dalam labu ukur 20 mL. Siapkan fase gerak metanol HPLC grade
dan Air HPLC grade.
2. Kalibrasi
a. Pompa
⮚ Uji Akurasi Aliran
1. Fase gerak yang digunakan: air
2. Laju alir yang diuji: 0,5 ml/menit ; 1 ml/menit; 2 ml/menit
3. Uji dilakukan pada kedua pompa secara terpisah
4. Kolom diganti dengan loop khusus yang dapat
memberikan tekanan tertentu
5. Atur laju alir pada 0,5 mL/menit
6. Biarkan selama kurang lebih 5-10 menit hingga stabil
7. Timbang labu ukur 5 ml. Pastikan labu ukur bersih dan
tidak bersentuhan langsung dengan tangan
8. Hentikan pompa, saluran outlet pembuangan dibersihkan
kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur
9. Hidupkan pompa dan hitung waktu dengan stopwatch
yang terkalibrasi
10. Pada waktu 5 menit yang tertera pada stopwatch,
hentikan pompa

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

11. Kemudian timbang labu ukur yang telah berisi tersebut

12. Perhitungan:
Berat air = berat labu ukur berisi – berat labu ukur kosong
Volume air = berat air/densitas air pada suhu ruangan kerja
Laju alir = volume air/5 menit
13. Kriteria Penerimaan: laju alir ± 2 %
Lakukan pula pengujian pada laju alir 1 ml/menit dan 2
ml/menit
⮚ Uji Akurasi Gradient
Bila HPLC dapat melakukan metode gradient dapat dilakukan
parameter ini. Metode yaitu Gunakan fase gerak aseton air
0,3%. Channel A : Air dan Channel B : Metanol
Siapkan larutan Caffein lakukkan running.

b. Detektor
Detektor dalam HPLC bisa detektor UV-Vis atau fluorometri.
Dilakukan Uji Akurasi panjang Gelombang dan Uji linearitas
Absorbansi.
⮚ Uji Akurasi Panjang Gelombang
1. Injeksikan larutan Caffein, perhatikan absorbansi yang
terbaca pada display, sampai absorbansi stabil
2. Setelah absorbansi stabil, ubah panjang gelombang
menjadi 266 nm
TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm
15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

3. Baca absorbansi pada display, kemudian catat

4. Ubah panjang gelombang menjadi 267 nm, kemudian
baca absorbansinya dan catat
5. Lakukan hal yang sama pada poin 4 dengan panjang
gelombang 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276,
dan 277 nm
6. Panjang gelombang maksimum adalah panjang
gelombang yang memberikan absorbansi terbesar. Catat
panjang gelombang tersebut
Kriteria penerimaan: panjang gelombang maksimum = 272 ± 2
nm
⮚ Uji Linearitas Absorbansi
1. Siapkan konsentrasi Caffein lakukkan running
2. gunakan fase gerak metanol air (60:40)
3. Siapkan larutan 10 ppm Caffein, masukkan dalam vial
4. Setting injeksi pada 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl dan 30 µl
5. Setiing injeksi sehingga masing masing larutan diambil
sebanyak 2 kali
6. Hitung persamaan luas kurva dengan konsentrasi
7. Print hasil analisis
8. Hitung nilai R
c. Autoinjektor
⮚ Uji Presisi Volume Injeksi
1. Siapkan larutan 10 ppm Caffein
2. Setting injeksi pada 5 µl, 10 µl dan 50 µl
3. Setting sehingga injektor mengambil sampel 5 µl sebanyak
10 kali
4. Setting sehingga injektor mengambil sampel 10 µl
sebanyak 10 kali
5. Hitung luas area

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Lakukan dengan membuat metode pada komputer Atau

manual  dengan membuat metode baru dengan parameter
setting berikut :
a. Timbang vial yang berisi 10 ppm Caffein gunakan pinset
untuk mengambil kemudian catat
b. Timbang vial 50 µl ambil dengan pinset, catat hasilnya
c. Setting sehingga injektor mengambil sampel 50 µl
sebanyak 10 kali
d. Selesai running Ambil vial menggunakan pinset kemudian
timbang catat hasilnya
e. Print dan Hitung RSD dari luas kurva, lakukkan perhitungan
presisi volume injeksi hanya pada vial 50 µl.
⮚ Uji Linearitas Volume Injeksi
Hitung Linearitas dari luas kurva volume injeksi 5 µl, 10 µl dan
50 µl versus luas kurva yang didapat dari Uji Presisi Volume
injeksi diatas.
⮚ Uji Carryover System
Buat metode baru dengan parameter
1. Buat fase gerak metanol 40% dan air 60%
2. Larutan standar Caffein 20 ppm
3. Kolom: C18 15 cm
4. Laju alir: 1,0 ml/menit, Detektor: UV 272 nm  dan Volume
injeksi 20 µl
5. Skema Injeksi:
● Injeksikan larutan standar Caffein 20 ppm
● Injeksikan fase gerak
● Injeksikan larutan standar Caffein 20 ppm
● Injeksikan fase gerak
● Injeksikan larutan standar Caffein 20 ppm
● Injeksikan fase gerak
6. Print semua hasil analysis

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

7. Hitung:
System carryover ditentukan dari kriteria penerimaan
berikut ini:
Luas Area Fase Gerak
Carryover : x 100 %
Luas Area Standar
Hitung masing-masing sehingga akan didapat 3 data
carryover
Kriteria penerimaan RSD≤1%
d. Oven Kolom
Bila HPLC dilengkapi dengan oven pemanas kolom maka dilakukan uji
untuk parameter ini.
⮚ Uji Akurasi Suhu
1. Pasang sensor digital thermometer pada bagian ruang
oven, pintu oven ditutup.
2. Lakukan setting berikut pada alat oven: suhu 40 °C
3. Tunggu suhu hingga stabil
4. Catat suhu yang tertera pada display alat.
5. Cata suhu yang ada pada thermometer jangan lupa untuk
memasukkan faktor koreksi thermometer
6. Kriteria penerimaan: Set Temp. ± 2,0 °C
e. Overall System Performace (OSP)
1. Lakukan System check dengan mengeklik menu Instrument,
print hasilnya. Bila PASS lanjutkan uji OSP.
2. Lakukan uji dengan larutan Caffein 50 ppm, seting injeksi
sebanyak 10 kali. Print hasil analisis. 
3. Hitung RSD dari retention time dan Luas area.
4. Kriteria penerimaan RSD≤2%.

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

BAB 3
METODE KERJA

3.1 Alat Praktikum

Adapun alat yang digunakan pada praktikum ini yakni, Labu
takar, Seperangkat alat HPLC, Mikropipet, Pinset, Termometer, dan
vial.
3.2 Bahan Praktikum
Adapun bahan yang digunakan pada praktikum ini yakni, Air
HPLC grade, aseton, larutan baku caffeine, methanol HPLC grade.
3.3 Cara Kerja
1. Akurasi Laju Alir
Disiapkan tabung pelarut yang berisi aquades khusus HPLC.
Kemudian disiapkan HPLC, atur laju aliran ke 0,500 mL/menit.
Tunggu sekitar 15 menit untuk menstabilkan system dan
memastikan bahwa tekanan stabil. Kemudian disiapkan labu ukur
10mL untuk menampung larutan yang keluar. Hentikan stopwatch
ketika larutan mencapai tanda 10mL pada labu ukur. Dicatat
waktu yang dibutuhkan sebagai waktu pengamatan. Diulangi
langkah tersebut untuk aliran 1,0 dan 2,0 mL/menit
2. Akurasi Injektor
Diisi vial dengan aquadest khusus HPLC dan tutup via dengan
benar. Ditimbang vial dan catat beratnya sebagai W1.
Ditempatkan vial tersebut dalam system kromatografi dan
dilakukan 6x injeksi @50 µL dari vial ini. Kemudian ditimbang lagi
vial dan dicatat beratnya setelah injeksi sebagai W2.
3. Presisi Sistem
Diinjeksikan larutan standar dengan konsentrasi tertentu.
Dicatat waktu retensi dan luas area puncaknya. Dilakukan 6x
pengulangan dan dicatat masing masing waktu retensinya dan
luas areanya.
4. Linearitas Detektor
TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm
15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Disiapkan 6 variasi konsentrasi larutan standar. Diinjeksikan

larutan standar dengan berbagai konsentrasi. Dicatat luas area
puncaknya. Kemudian dibuat grafik hubungan rentang konsentrasi
dan luas area puncak

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

1. Bagain Instrumen HPLC

Pengumpulan Data Para meterSub bagian (jika ada) Kegunaan
dan Hasil kalibrasinya

Pompa 1.Akurasi 1. Pompa untuk mendorong eluen

laju alir dengan dan sampel
tekanan tersebut masuk ke
2.Akurasi
konstan dalam kolom.
gradient 2. Pompa
dengan
aliran fase
gerak yang
konstan

Autosampel 1. Lineritas 1. Syringe Sebagai tempat

autoinjekto injektor memasukkan
r 2. loop valve sampel dan
2. Carryover 3. Automatic kemudian sampel
sistem injector dapat
(autosampel) terdistribusikan
masuk ke dalam
kolom.

3 Kolom Akurasi suhu 1. Kolom untuk

konvensional memisahkan
2. Kolom senyawa yang
mikrobor ada dalam
sampel.

4 Detektor 1. Lineritas 1. Detektor berfungsi

detector universal membaca
2. Drift & 2. Detektor senyawa yang
niose spesifik lewat ke dalam
detektor.

2. Parameter Akurasi Laju Alir

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
 KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Pengumpulan Data dan Hasil Jawaban

Larutan Uji Aquadest pro HPLC

1. Laju alir :
a. a. 0,5 mL/menit
b. b. 1 mL/ menit
c. c. 2 mL/ menit
2. Waktu teori :
a. a. 20 menit
b. b. 10 menit
c. c. 5 menit
3. Selisih (persen)
a. a. 2,5 %
b. b. - 2%
c. c. -2 %
4. Kriteria keberterimaan Selisih waktu teori dan
pengamatan lebih
kurang 2 %
Akurasi laju alir pada laju alir
b dan c memenuhi
5. Kesimpulan syarat sedangkan
pada laju alir a tidak
memenuhi syarat
ketentuan.

Perhitungan :
|waktu teori−waktu pengamatan|
Selisish Waktu a = X 100 %
waktu teori
|20−19,5|
= X 100 %
20
= 2.5%
|waktu teori−waktu pengamatan|
Selisish Waktu b = X 100 %
waktu teori
|10−10,2|
= X 100 %
10
= - 2%
|waktu teori−waktu pengamatan|
Selisish Waktu c = X 100 %
waktu teori

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
 KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

¿
= ¿ 5−5,1∨ 5 X 100 % ¿

= - 2%
3. Parameter Akurasi Injektor
Pengumpulan Data dan Hasil Jawaban

Larutan uji Aquadest khusus HPLC

Berat awal (W1) 2,5 gr

Jumlah pengulangan injeksi 6x injeksi

3 Volume yg diinjeksikan 50 µL

4 Berat akhir setelah diinjeksikan 2 gr

5 Volume injeksi 80 µL

6 Kriteria keberterimaan 50,0 ± 1,0 µL

7 Kesimppulan Volume rata-rata

injector tidak
memenuhi
persyaratan
keberterimaan
W 1−W 2
Perhitungan injeksi = xρ
6
2,5 g−2 g
= x 1g/mL
6
= 0,08 mL = 80 mikroliter
4. Paremeter Presisi Sistem
Pengumpulan Data dan Hasil Jawaban

Larutan Uji Larutan Standar

Tertentu

konsentrasi :
a. 30
a. b. 30
b. c. 30
d. 30
c. e. 30

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

d. f. 30

e.

f.

3 Luas Area masing-2 konsentrasi

a. 9302120
a. b. 9311012
b. c. 9345601
d. 9348797
c. e. 9315692
f. 9319222
d.

e.

f.

4 Persamaan SD √❑

5 Persamaan RSD SD
~x x 100 %

7 Hasil yang diidapatkan 3.98 %

6 Kriteria keberterimaan < 1.0 %

7 Kesimpulan Tidak memenuhi syarat

keberterimaan

5. Parameter Linieritas Detektor

Pengumpulan Data dan Hasil Jawaban

Larutan Uji

Variasi konsentrasi :

a.

b.

c.

d.

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

e.

3 Luas Area masing-2 konsentrasi

a. 3144434
a. b. 6284565
b. c. 9317451
d. 12282011
c. e. 14839500

d.

e.

4 Persamaan regresi y = bx + a

5 Koofisien regresi = 0,9986

6 Kriteria keberterimaan = ≥0,99

7 Kesimpulan Memenuhi syarat,

karena nilai
koefisien regresi
yang diperoleh
0.9986 dimana
melebihi 0.99.

Kurva baku

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

4.2 Pembahasan
Kalibrasi merupakan serangkaian kegiatan yang dilakukan
untuk mengetahui perbedaan antara pembacaan alat ukur dan
standar dari alat ukur tersebut. Kalibrasi dilakukan untuk
meminimalkan kesalahan pembacaan dari alat yang digunakan yang
mungkin terjadi pada proses pengukuran, sehingga data yang
diperoleh bisa akurat dan bisa dijadikan sebagai acuan atau referensi
data.
Alat yang digunakan dalam percobaan ini yaitu kalibrasi KCKT
(kromatografi cair kinerja tinggi) atau biasa juga dikenal HPLC (hight
performance liquid chromatography). KCKT merupakan teknik
kromatografi yang digunakan pada zat cair disertai tekanan tinggi.
KCKT digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan afinitas
terhadap zat pada tertentu.
Pompa pada KCKT berfungsi sebagai pendorong eluen
sehingga sampel dapat masuk ke dalam kolom. Parameter kalibrasi
yang dilakukan pada pompa yakni akurasi laju alir. Hasil yang
diperoleh pada laju alir 0,5 mL/menit, 1 mL/menit, 2 mL/menit berturut-
turut yaitu sebesar 2,5%; -2% dan -2%. Dimana kriteria penerimaan

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

pada parameter akurasi laju alir yaitu selisih waktu teori dan
pengamatan sebesar ±2%. Dari hasil yang diperoleh, laju alir b dan c
memenuhi syarat sedangkan pada laju alir a tidak memenuhi syarat
keterterimaan.
Injektor pada KCKT berfungsi sebagai tempat memasukkan
sample dimana sampel kemudian aka terdistribusikan masuk ke
dalam kolom. Parameter kalibrasi yang dilakukan pada injector yakni
akurasi injector. Hasil yang diperoleh pada akurasi injector yaitu hasil
volume injeksi sebesar 80 µL. Dimana kriteria penerimaan pada
parameter akurasi injector yaitu 50,0 ± 1,0 µL. Dari hasil yang
diperoleh dapat dilihat bahwa parameter akurasi injector tidak
memenuhi syarat keterterimaan.
Parameter presisi system bertujuan untuk melihat hasil
keberulangan pada pengujian yang diperoleh untuk menghasilkan
data yang sama dan memenuhi syarat keterterimaan. Dimana kriteria
keterterimaan pada parameter presisi system berupa nilai RSD <
1,0%. Hasil yang diperoleh pada parameter presisi system yaitu
3,98%. Dari hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa parameter ini
tidak memenuhi syarat keterterimaan.
Parameter lineritas detector dilakukan untuk melihat bagaimana
lineritas dari pembacaan senyawa oleh detector. Dimana kriteria
keterterimaan pada parameter lineritas berupa nilai regresi (R 2) ≥0,99.
Hasil yang diperoleh pada parameter lineritas yaitu 0,9986. Dari hasil
yang diperoleh dapat dilihat bahwa parameter ini memenuhi syarat
keterterimaan.

BAB 5
TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm
15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan dalam percobaan kali ini yaitu instrument
KCKT tidak layak digunakan dalam pengukuran berdasarkan dari hasil
parameter kalibrasi karena pada parameter akurasi laju alir dan
akurasi injector, persisi system tidak memenuhi syarat keterterimaan
sedangkan lineritas detector memenuhi syarat keterterimaan.
5.2 Saran
Adapun saran dalam percobaan kali ini yaitu agar proses
kalibrasi KCKT dapat dilakukan secara langsung sehingga materi bisa
dipahami secara baik

DAFTAR PUSTAKA
TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm
15020180177
KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Anonim. 2020. Penuntun Praktikum Analisis Instrumen. UMI: Makassar.

Ardianingsih, R. 2009. Penggunaan High Performamance Liquid

Chromatography (HPLC) Dalam Proses Analisa Deteksi Ion.
Berita Dirgantara. Vol. 10 No. 4.

Ditjen POM. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Departemen Kesehatan

Indonesia: Jakarta.

Ditjen POM. 2014. Farmakope Indonesia Edisi V. Departemen Kesehatan

Indonesia: Jakarta.

Fatimah, Soja, 2003. Kalibrasi dan Perawatan Spektrofotometer UV-Vis.

Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI: Bandung.

Hadi, Anwar. 2005. Prinsip Pengelolaan Lingkungan. Gramedia Pustaka

Umum: Jakarta.

ISO, International Standart Operational, 2005, ISO/IEC 17025 (Versi

Bahasa Indonesia) Persyaratan Umum Kompetensi Laboratorium
Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi.

Lestari, Wahyuni Sri, 2014. Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren

dalam Plasma darah secara In Vitro Menggunakan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT). UIN Syarif Hidayatullah: Jakarta.

Rohman, Abdul. 2013. Kimia Analisis Farmasi. Pustaka Pelajar : Jakarta.

Underwood. 2002. Panduan Riset Perilaku Konsumen. Gramedia: Jakarta.

LAMPIRAN

SKEMA KERJA

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
 KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

1. Akurasi Laju Alir

Disiapkan tabung pelarut yang berisi aquades khusus HPLC.
⇓
Kemudian disiapkan HPLC, atur laju aliran ke 0,500 mL/menit.
⇓
Tunggu sekitar 15 menit untuk menstabilkan system dan memastikan bahwa
tekanan stabil.
⇓
Kemudian disiapkan labu ukur 10mL untuk menampung larutan yang keluar.
⇓
Hentikan stopwatch ketika larutan mencapai tanda 10mL pada labu ukur.
⇓
Dicatat waktu yang dibutuhkan sebagai waktu pengamatan.
⇓
Diulangi langkah tersebut untuk aliran 1,0 dan 2,0 mL/menit
2. Akurasi Injektor
Diisi vial dengan aquadest khusus HPLC dan tutup vial dengan benar.
⇓
Ditimbang vial dan catat beratnya sebagai W1.
⇓
Ditempatkan vial tersebut dalam system kromatografi dan dilakukan 6x
injeksi @50 µL dari vial ini.
⇓
Kemudian ditimbang lagi vial dan dicatat beratnya setelah injeksi sebagai
W2.

3. Presisi Sistem
Diinjeksikan larutan standar dengan konsentrasi tertentu.
⇓
Dicatat waktu retensi dan luas area puncaknya.
⇓

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177
 KALIBRASI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Dilakukan 6x pengulangan.
4. Linearitas Detektor
Disiapkan 6 variasi konsentrasi larutan standar.
⇓
Diinjeksikan larutan standar dengan berbagai konsentrasi.
⇓
Dicatat luas area puncaknya.
⇓
Kemudian dibuat grafik hubungan rentang konsentrasi dan luas area puncak.

TAMAR SAMAWATI A RHIZKA ASHOKAWATI, S.Farm

15020180177