Praktikum Kalibrasi Alat TA 2020/2021

DIII Analisis Kimia UII

Kelas : B Shift: 2

Kalibrasi High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Aprilia Kurnia Putri (18231080)

ARTIKEL INFO ABSTRAK

Received : High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau
Revised : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah
Published : 12 Juli 2020 kromatografi cair kolom modern, dimana teori dasarnya
Kata Kunci : HPLC, kalibrasi, akurasi, hasil pengembangan dari kromatografi cair kolom klasik.
presisi Pompa tekanan tinggi dan detektor yang peka telah
menyebabkan perubahan kromatografi cair kolom menjadi
suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien. Ada dua hal
yang penting dalam HPLC yaitu separasi atau pemisahan
dan identifikasi. Kalibrasi merupakan proses verifikasi
bahwa suatu akurasi alat ukur sesuai dengan rancangannya.
Kalibrasi biasa dilakukan dengan membandingkan suatu
standar yang terhubung dengan standar nasional maupun
internasional dan bahan-bahan acuan tersertifikasi. Tujuan
kalibrasi High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) untuk mengetahui nilai perbedaan dari pembacaan
alat dibandingkan dengan standar. Sehingga dapat
menjamin data yang valid. Kalibrasi merupakan bagian dari
standard sistem mutu yang mengacu pada SNI 17025:2017
mengimplikasikan instrument suatu laboratorium harus
dikalibrasi terhadap pembanding yang memiliki
ketelusuran. Paramater yang dianalisis dalam kalibrasi
HPLC adalah akurasi laju alir, akurasi injektor, presisi
sistem, linieritas detektor. Hasil yang diperoleh dari
parameter tersebut yaitu akurasi laju alir pada 2 mL/menit
sebesar 1,90%; akurasi injektor sebesar 53,45%; presisi
waktu retensi sebesar 0,18%; presisi luas area sebesar
0,91%; linieritas detektor Y = 44291x + 15630 dengan nilai
regresi R2 = 0,9231 dan r = 0,9607. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa akurasi injektor dan linieritas detektor
tidak memenuhi syarat keberterimaan.
1. PENDAHULUAN
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan komponen-
komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi
zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau
landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang
bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“
(tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut
akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada
kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain
dari alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara
komponen-komponen yang ada. (Bahti, 2011).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran yang
berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak
dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya
menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa
Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). Teknik HPLC merupakan suatu metode
Praktikum Kalibrasi Alat TA 2020/2021
DIII Analisis Kimia UII
Kelas : B Shift: 2

kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis
kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar.
Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang
akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan
menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 : 17)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (Hight
Performance Liquid Chromatograhy) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-
an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan,
bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antara
lain : miniaturisasi sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis
protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa kiral (Rohman, 2013).
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi
dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui
informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk
mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample (Riyadi, 2009).
Mekanisme kerja HPLC adalah fase gerak air dialirkan dengan pompa melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkanke datigum aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom
terjadi pemisahan komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuatan interaksi antara salut-salut
terhadap fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen campuran
yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram
(Lestari, 2014).
Kalibrasi adalah serangkaian kegiatan yang membentuk hubungan antara nilai yang ditunjukkan
oleh instrumen pengukur atau sistem pengukuran dengan nilai-nilai yang sudah diketahui yang
berkaitan dari besaran-besaranyang diukur dalam kondisi tertentu. Sedangkan defenisi kalibrasi
menurut Dewan Standarisasi Nasional (DSN/1990) adalah suatu kegiatan untuk menentukan
kebenaran konvensional penunjukan instrument ukur dan bahan ukur dengan cara membandingkan
terhadap standar nasional dan/atau internasional. Selain itu kalibrasi juga dapat dikatakan sebagai
kegiatan peneraan untuk menentukan kebenaran nilai penunjukan alat ukur dan/atau bahan ukur
(defenisi : Permenkes No.363 Tahun 1998).
Menurut ISO/IEC Guide 17025:2005 dan vocabulary of international metodology, kalibrasi
adalah kegiatan yang mengubungkan nilai yang ditunjukkan oleh instrument ukur atau nilai yang
diwakili oleh bahan ukur dengan nilai yang sudah diketahui tingkat kebenarannya (terkait dengan
kisaran yang diukur). Kalibrasi yang biasa dilakukan dengan membandingkan suatu standarisasi (ISO,
2005). Tujuan kalibrasi adalah menentukan deviasa atau penyimpangan kebenaran nilai konvensional
penuntukkan suatu instrumen ukur, menjamin hasil-hasil pengukuran sesuai dengan standar nasional
maupun internasional. Manfaat kalibrasi ini adalah menjaga kondisi instrumen ukur dan bahan ukur
agar tetap sesuai dengan spesifikasinya. Kemampuan untuk tepat mengukur volume larutan sangat
penting untuk akurasi dalam kimia analisis. Periode kalibrasi tergantung pada beberapa faktor antara
lain pada kualitas metrologis alat ukur tersebut, frekuensi pemakaian, pemeliharaan atau penyimpanan
dan tingkat ketelitianya.Periode kalibrasi dapat ditetapkan berdasarkan lamanya pemakaian alat,
waktu kalender atau gabungan dari keduanya (Fatimah, 2005)
2. METODE
2.1. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan yaitu seperangkat alat HPLC, ultrasonik, gelas beker, kertas saring, neraca
analitik, labu takar 50 mL.
Bahan yang digunakan adalah akuades, tissu, parasetamol standar, metanol
2.2. Cara kerja
2.2.1. Pembuatan fasa gerak
Praktikum Kalibrasi Alat TA 2020/2021
DIII Analisis Kimia UII
Kelas : B Shift: 2

Campuran dibuat perbandingan antara metanol : akuades (7:3) sebanyak 500

mL. Larutan dihomogenkan pada ultrasonik.
2.2.2. Pembuatan larutan standar 100 ppm
5 mg standar parasetamol dan dilarutkan dalam fase gerak pada labu ukur 50
mL. Larutan standar diultrasonik hingga homogen dan disaring.
2.2.3. Optimasi alat HPLC
Tekanan laju alir fasa gerak ditentukan sesuai yang telah dtentukan dan dipilih
jenis pompa yang akan digunakan.
2.2.4. Penentuan laju alir
Tabung pelarut diisi dengan akuades khusus HPLC. Laju aliran diatur ke
0,500 mL/menit dan ditunggu sekitar 15 menit untuk menstabilkan sistem dan
memastikan bahwa tekanan stabil. Labu ukur 10 mL disiapkan untuk menampung
larutan yang keluar. Stopwatch dihentikan ketika larutan mencapai tanda 10 mL pada
labu ukur. Waktu yang dibutuhkan dicatat sebagai waktu pengamatan dan diulangi
untuk aliran 1,0 dan 2,0 mL/menit.
2.2.5. Penentuan akurasi injektor
Tabung vial diisi dengan akuades khusus HPLC dan tutup vial dengan benar.
Tabung vial ditimbang dan dicatat beratnya sebagai W1. Tabung vial ditempatkan
dalam sistem kromatografi dan dilakukan 6 kali pengulangan @50 µL dari vial
tersebut. Tabung vial ditimbang lagi dan dicatat hasilnya sebagai W2.
2.2.6. Pengukuran waktu retensi dan luas area
Larutan dimasukkan dalam vial. Waktu retensi dan luas area diukur dengan
HPLC. Penggulangan dilakukan sebanyak 5 sampai 6 kali.
2.2.7.Pengukuran linieritas detektor
Larutan standar diinjeksikan dengan berbagai konsentrasi. Luas area puncak
dicatat dan dibuat grafik hubungan antara konsentrasi dan luas area puncak.

3. HASIL PRAKTIKUM
Kalibrasi merupakan proses pengecekkan dari suatu insrtrumen dengan melakukan perbandingan
pada standar atau tolok ukur yang berlaku pada suatu laboratorium. Kalibrasi dilakukan untuk
menjaga spesifikasi alat yang digunakan sehingga hasil yang diperoleh valid atau benar. Fungsi
dilakukannya kalibrasi untuk alat HPLC adalah untuk menetapkan ataupun memastikan apakah
kondisi HPLC masih dapat digunakan dan memberi hasil data yang akurat dan presisi.
Hight Performance Liquid Chromatograhy (HPLC) merupakan salah satu metode pemisahan
komponen-komponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen
sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Prinsip kerja dari HPLC yaitu sampel
diinjeksikan ke dalam aliran fase gerak dengan bantuan pompa akan dialirkan menuju kolom. Di
dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solut-solut dengan fase diam, maka solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fase diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen yang keluar dari
kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Hasil yang
diperoleh dari perhitungan parameter akurasi laju alir, akurasi injektor, presisi sistem dan linieritas
detektor yaitu, sebagai berikut:
3.1. Akurasi
Praktikum Kalibrasi Alat TA 2020/2021
DIII Analisis Kimia UII
Kelas : B Shift: 2

Akurasi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan
kadar analit sebenarnya. Akurasi dapat menggunakan standar yang telah diketahui nilai
sebenarnya pada rentang linieritas (kadar rendah dan tinggi). Hasil akurasi yang diperoleh
kemudian dibandingkan dengan sertifkat CRM atau metode uji untuk menententukan
kesimpulannya. Penentuan akurasi pada kalibrasi HPLC dibagi menjadi 2 yaitu uji akurasi
laju alir dan akurasi injektor
a. Akurasi Laju Alir
Akurasi laju alir dalam kalibrasi HPLC dapat dinyatakan dalam Persamaan 1.
Dimana syarat keberterimaan akurasi laju alir adalah selisih waktu teori dan waktu
pengamatan ± 2%. Hasil yang diperoleh pada Tabel 1 menunjukkan hasil pada laju alir
0,5 mL/menit didapatkan akurasi sebesar 0,97%, laju alir 1 mL/menit didapatkan hasil
0,80 mL/menit dan laju alir 2 mL/menit didapatkan hasil akurasi sebesar 1,90 %. Dimana
pada laju alir 2 mL/menit ini hasilnya mendekati syarat keberterimaan yaitu ± 2%.
Sehingga dapat disimpulkan hasil yang diperoleh valid.
[Waktu teori−Waktu pengamatan]
Akurasi laju alir = x 100% Persamaan 1
Waktu teori

Tabel 1. Hasil Uji Akurasi Laju Alir

Laju Alir
(mL/menit Volume Waktu Waktu Akurasi Laju
) Pengulangan Akhir (mL) (menit) Rata-rata Teori Alir
1 20,05
2 20,23
3 20,5
0,5 10 20,195 20 0,975
4 19,85
5 20,21
6 20,33
1 9,98
2 10,17
3 10,35
1 10 10,08 10 0,8
4 9,68
5 10,06
6 10,24
1 5,31
2 5,07
3 5,19
2 10 5,095 5 1,9
4 4,88
5 4,91
6 5,21

b. Akurasi Injektor
Akurasi injektor dalam kalibrasi HPLC dapat dinyatakan dalam Persamaan 2.
Dimana syarat keberterimaan akurasi injektor adalah volume rata-rata injektor 50,0 ±
1,0µL. Hasil yang diperoleh pada Tabel 2. menunjukkan hasil pada akurasi injektor
diperoleh sebesar 53,4 µL
Praktikum Kalibrasi Alat TA 2020/2021
DIII Analisis Kimia UII
Kelas : B Shift: 2

W 1−W 2
Volume injeksi = :ρ Persamaan 2
6

Tabel 2. Hasil Uji Akurasi Injektor

Volume
No Parameter Nilai
injeksi (µL)
1 Massa awal 538,2 mg
2 Massa akhir 217,8 mg 53,4
3 Densitas 0,9982 mg/ µL

3.2. Presisi
Presisi atau precision ialah derajat kemiripan antara hasil uji individual yang diukur
dengan penyebaran hasil individual berdasarkan rata-rata bila prosedur dilakukan secara
berulang terhadap sampel yang diperoleh dari campuran yang telah homogen. Presisi diukur
sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variansi). Precision dapat
dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility (kebolehulangan). Presisi
pada kalibrasi HPLC ada 2 yaitu pesisi waktu retensi dan presisi hasil penngukuran (%luas
area).
a. Presisi dengan Waktu Retensi

Tabel 3. Hasil Uji Presisi Waktu Retensi sistem

Waktu Retensi
Pengulangan (menit) SD %Presisi
1 1,701
2 1,703
3 1,706
0,0031 0,18
4 1,703
5 1,71
6 1,705
Rata-rata 1,705    

Berdasarkan data yang diperoleh pada Tabel 3. Hasil %Presisi yang diperoleh
yaitu sebesar 0,18%. Hasil ini memenuhi syarat keberterimaan yaitu kurang dari 1%.
Sehingga dapat disimpulkan bahwa presisi pada percobaan ini valid.

b. Presisi dengan Konsentrasi atau % Luas Area

Praktikum Kalibrasi Alat TA 2020/2021
DIII Analisis Kimia UII
Kelas : B Shift: 2

Tabel 4. Hasil Uji Presisi dengan Konsentrasi atau % Luas Area

Pengulangan Luas Area SD %Presisi

1 3143,664
2 3152,221
3 3111,132
28,4281 0,91
4 3178,291
5 3099,782
6 3139,567
Rata-rata 3137,443    

Berdasarkan data yang diperoleh pada Tabel 4. Hasil %Presisi yang diperoleh
yaitu sebesar 0,91%. Hasil ini memenuhi syarat keberterimaan yaitu kurang dari 1%.
Sehingga dapat disimpulkan bahwa presisi pada percobaan ini valid.
3.3. Linieritas Detektor

Kurva Kalibrasi Standar Paracetamol

40000
35000 f(x) = 44290.67 x + 15629.81
R² = 0.92
30000
25000
Luas Area

20000
15000
10000
5000
0
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55
Konsentrasi (%)
Linieritas diperoleh dengan dilakukan pengukuran absorbansi larutan seri standar.
Tujuan dilakukannya pengukuran ini adalah untuk memperoleh persamaan garis regresi dari
kurva kalibrasi yang dibuat. Uji linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r). Hasil
pengukuran dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Kurva penentuan linieritas detektor pengukuran standar paracetamol

Berdasarkan Gambar 1. dapat diketahui persamaan garis liniear adalah Y = 44291x +

15630 dengan nilai regresi R2 = 0,9231 dan r = 0,9607 . Panggabean (2014) menyatakan
bahwa sebagai parameter terdapatnya kaitan linear digunakan koefisien (r) pada pengujian
regresi linier y = a + bx. Persyaratan yang memenuhi kriteria untuk koefisien korelasi ialah
sebesar r ≥ 0,99. Nilai koefisien yang diperoleh sebesar 0,9607 menyatakan bahwa hasil data
linieritas detektor dinyatakan tidak valid.

4. KESIMPULAN
Prinsip kerja dari HPLC yaitu sampel diinjeksikan ke dalam aliran fase gerak dengan bantuan
pompa akan dialirkan menuju kolom. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut dengan fase diam, maka solut-solut
yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu dan
sebaliknya. Setiap komponen yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam
Praktikum Kalibrasi Alat TA 2020/2021
DIII Analisis Kimia UII
Kelas : B Shift: 2

dalam bentuk kromatogram. Fungsi dilakukannya kalibrasi untuk alat HPLC adalah untuk
menetapkan ataupun memastikan apakah kondisi HPLC masih dapat digunakan dan memberi hasil
data yang akurat dan presisi.
Berdasarkan hasil dari percobaan perawatan dan kalibrasi HPLC didapatkan hasil sebagai berikut:
- Akurasi laju alir pada laju alir 0,5 mL/menit didapatkan akurasi sebesar 0,97%, laju alir 1
mL/menit didapatkan hasil 0,80 mL/menit dan laju alir 2 mL/menit didapatkan hasil akurasi
sebesar 1,90% (memenuhi syarat keberterimaan yaitu ± 2% pada laju alir 2 mL/menit)
- Akurasi injektor sebesar 53,4% ( tidak memenuhi syarat keberterimaan yaitu 50,0 ± 1,0µL)
- Presisi waktu retensi sebesar 0,18% (memenuhi syarat keberterimaan yaitu kurang dari 1%)
- Presisi konsentrasi atau %Luas area sebesar 0.91% (memenuhi syarat keberterimaan yaitu kurang
dari 1%)
- Linieritas detektor Y = 44291x + 15630 dengan nilai regresi R 2 = 0,9231 dan r = 0,9607 (tidak
memenuhi syarat keberterimaan yaitu r ≥ 0,99)

Daftar Pustaka
Bahti. (2011). Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Bandung : Universitas Padjajaran.
Fatimah, S, Yanlinastuti dan Yoskasih. (2005). Kualifikasi Alat Spektrometer UV-Vis Untuk
Penentuan Uranium dan Besi dalam-U30. Hasil penelitian
K. RI, “Peraturan Menteri Kesehatan No 363/Menkes/PER/IV/1998 tentang Pengujian dan Kalibrasi
Alat Kesehatan pada Sarana Pelayanan Kesehatan,” kemenkes RI, 2015.
Lestari, Wahyuni Sri, 2014, Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren dalam Plasma darah secara
In Vitro Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). UIN Syarif
Hidayatullah: Jakarta
Riyadi, Wahyu. (2010). Validasi Metode Analisis. Chem-Is-Try
Rohman, Abdul., (2013). Kimia Analisis Farmasi. Jakarta : Pustaka Pelajar
Wiji. Anna Permatasari, dkk. (2010). Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen. Bandung :
Jurusan Pendidikan Kimia FMIPA UPI.