MAKALAH

ANALIS FARMASI

VALIDASI METODE ANALISA

Oleh :
1. NURNUL SUKMA (14144)
2. RINDA SEPTY A (14161)
3. ZULYA VINDY (14206)
4. FRISQILLA CLAUDIA (14074)
5. MUALIFATUL LAILIA(14127)
6. JULIATI WAHYU NINGSIH (14095)
7. HESTY NUR ISNAINI (14081)
8. TRI UTARI (14183)
9. FEBRIANTO (14060)

AKADEMI FARMASI PUTRA INDONESIA MALANG

NOVEMBER 2016
 VALIDASI METODE ANALISA
1. Definisi
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Validasi
merupakan suatu proses evaluasi kecermatan dan keseksamaan yang dihasilkan oleh
suatu prosedur dengan nilai yang dapat diterima. Validasi memastikan bahwa suatu
prosedur tertulis memiliki detail yang cukup jelas.
Definisi validasi:
a. Menurut SK Menkes RI No.43/MENKES/SK/1998 tentang CPOB adalah
tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa bahan, prosedur, kegiatan,
sistem, perlengkapan atau mekanisme dalam produksi dan pengawasan
senantiasa mencapai hasil yang diinginkan.
b. Menurut ISO (International Standarts Organization) 17025 validasi adalah
konfirmasi dengan pemeriksaan dan penyediaan bukti obyektif bahwa
persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus yang terpenuhi.
c. Menurut Quality Assurance Standarts for Forensic DNA Testing Laboratories,
validasi adalah proses dimana prosedur dievaluasi untuk menentukan kemanjuran
dan keandalan untuk analisis, untuk menunjukkan metode tersebut cocok untuk
tujuan yang dimaksudkan.
d. Menurut USP, validasi metode fdilakukan untuk menjamin bahwa metode
analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusible dan tahan pada kisaran analitik
yang akan dianalisis.
Istilah validasi pertama kali dicetuskan oleh Dr. Bernard T. Loftus, Direktur
Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat pada akhir tahun 1970-an,
sebagai bagian penting dari upaya untuk meningkatkan mutu produk industri farmasi.
Hal ini dilatar belakangi oleh berbagai masalah mutu yang timbul pada saat itu yang
mana masalah-masalah tersebut tidak terdeteksi dari pengujian rutin yang
dilaksanakan oleh industri farmasi yang bersangkutan.
 Biasanya validasi digunakan untuk metode analisa yang baru dibuat dan
dikembangkan. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku
(misal AOAC,ASTM) namun metode tersebut baru pertama kali akan digunakan di
laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu dilakukan validasi namun hanya verifikasi.
Verifikasi adalah konfirmasi ulang dengan cara menguji suatu metode dengan
melengkapi bukti-bukti yang objektif dan sudah memenuhi persyaratan.
2. Pentingnya Validasi
Validasi metode sangat diperlukan karena beberapa alasan yaitu validasi metode
merupakan elemen penting dari kontrol kualitas, validasi membantu memberikan
jaminan bahwa pengukuran akan dapat diandalkan. Dalam beberapa bidang, validasi
metode adalah persyaratan peraturan.
3. Tujuan
Adapun tujuan validasi metode analisi adalah sebagai berikut:
1. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengonfirmasikan
bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya.
2. Untuk menghasilkan hasil analisis yang paling baik.
4. Proses validasi
Proses validasi dilakukan dengan 4 langkah:
1. Validasi perangkat lunak (software validation)
2. Validasi perangkat keras/ instrumen (instrumen/ hardware validation)
3. Validasi metode
4. Kesesuaian system (system suitability)
5. Parameter Validasi
Menurut USP beberapa langkah dalam validasi metode analisis sebagai berikut:
1. Akurasi (ketepatan)
2. Presisi
3. Selektifitas (spesifisitas)
4. Linearitas dan rentang
5. Batas deteksi dan batas kuantitasi
6. Ketangguhan metode
7. Kekuatan metode
 AKURASI
1. Definisi
Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis
dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan
kembali (recovery) analit yang ditambahakan. Akurasi merupakan derajat ketepatan
antara nilai yang diukur dengan nilai sebenarnya yang diterima (Gray, 1996). Akurasi
merupakan kemampuan metode analisa untuk memperoleh nilai benar setelah
dilakukan secara berulang. Jika nilai replika analisis semakin dekat dengan sampel
yang sebenarnya maka semakin akurat metode tersebut (Khan, 1996).
Kesulitan utama dalam evaluasi akurasi adalah fakta bahwa kandungan
sesungguhnya analit yang akan diuji tidak diketahui. Akurasi dinyatakan sebagai
persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.
2. Metode akurasi
Akurasi dapat ditentukan melalui beberapa cara, yaitu:
a. Metode simulasi (spiked-placebo recovery)
Dalam metode ini, sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia
CRM atau SRM) ditambahkan ke dalam plasebo (semua campuran bahan pembawa
sediaan farmasi), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan
kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Dalam metode penambahan
baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke
dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandigkan dengan
kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam kedua metode tersebut, persen
perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil
yang sebenarnya. % perolehan kembali dapat ditentukan dengan cara membuat
sampel placebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan
konsentrasi tertentu (biasanya 80% - 120% dari kadar analit yang diperkirakan),
kemudian dianalisis dengan metode yang akan di validasi (Harmita, 2004).
Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriksnya
tidak diketahui seperti obat-obat an paten, atau karena analitnya berupa suatu
senyawa endogen misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai
metode adisi (Harmita, 2004).

b. Metode adisi ( penambahan baku )

Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi.
Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu
pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi,
mengubah pH atau kapasitas dapar.
Kedua metode tersebut recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang
diperoleh dengan hasil yan sebenarnya. Biasanya persyaratan untuk recovery adalah
tidak boleh lebih dari 5%.
Perhitungan perolehan kembali dapat juga ditetapkan dengan rumus sebagai
berikut:
(C 1C 2)
% perolehan kembali (recovery) = C3
C1 = konsentrasi dari analit dalam campuran contoh + sejumlah tertentu analit.
C2 = konsentrasi dari analit dalam contoh.
C3 = konsentrasi dari analit yang ditambahkan ke dalam contoh.
Niali persen recovery berdasarkan nilai konsentrasi sampel.
Tabel:
Analit pada matriks sampel Recovery yang diterima (%)
10 < A 100 (%) 98 102
1 < A 10 (%) 97 103
0,1 < A 1 (%) 95 105
0,001 < A 0,1 (%) 90 107
100 ppb < A 1 ppm 80 110
10 ppb < A 100 ppb 60 115
1 ppb < A 10 ppb 40 120

NB : recovery adalah persen perolehan kembali

 PRESISI (KESEKSAMAAN)
1. Definisi
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil
uji individual, diukur melalu penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur
diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang
homogeny (Harmita, 2004). Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau
simpangan baku relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai
keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility).
Reapitibility (keterulangan) adalah keseksamaan metode jika dilakukan
berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dalam interval waktu yang
pendek. Repeatibility dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap
terhadap sampel-sampel identik yang terpisah lengkap terhadap sampel-sampel
identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan
pada kondisi yang normal.
Reproducibility (ketertiruan) adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada
kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan pada laboratorium-laboratorium
yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut dan analis yang berbeda pula.
Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari
batch yang sama. Reproducibility dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang
sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi dan analis yang berbeda.
Kesesuaian dengan ICH, presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda
yaitu:
a. Keterulangan yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang sama
(berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya maupun waktunya.
b. Presisi antara yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang
berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya.
c. Ketertiruan merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang lain. (Gandjar
dan Rohman, 2009)
 Pengujian presisi pada saat awal validasi metode seringkali hanya
menggunakan 2 parameter pertama yaitu keterulangan dan presisi antara.
Reprodusibilitas biasanya dilakukan ketika akan melakukan uj banding antar
laboratorium (Gandjar dan Rohman, 2009).
Menurut Harmita (2009), keterulangan adalah keseksamaan metode jika
dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval
waktu yang pendek. Keterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah
lenglap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi
memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. Sedangkan yang
dimaksud ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang
berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda
menggunakan peralatn, pereaksi, pelarut dan analis yang berbeda pula. Analis
dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang
sama. Kriteria seksama diberikan jika metode meberikan simpangan baku relatif atau
koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung
pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium.
Ditemukan bahwa koefisien variasi eningkat dengan menurunnya konsentrasi analit.
Pada kadar 1% atau lebih, standart deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar
2,5% ada pada satu per seribu adalah %%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya
adalah 16%, dan pada kadar part per billion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang
snagat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2% (Harmita, 2004).
Untuk menentukan metode ketertiruan sebagai berikut:

RSD < 2 (1-0,5 log c)

untuk metode keterulangan sebagai berikut:

RSD < 2 (1-0,5 log c) x 0,67

 c = konsentrasi analit sebagai fraksi desimal (contoh: 0,1% = 0,001)

(Harmita, 2004).

Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:

1. Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,.....................xn maka simpangan bakunya
adalah:

2.
3. Simpangan baku relatif atau koefisisen variasi (KV) adalah:

Percobaan seksama dilakukan terhadap palig sedikit enam replika sample yang
diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen. Sebaiknya
keseksamaan ditentukan terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa campuran dengan
bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) untuk melihat pengaruh matriks pembawa
tterhadap keseksamaan ini. Demikian juga harus disiapkan sampel untuk
menganalisis pengaruh pengotor dan hasil degradasi terhadap keseksamaan ini
(Harmita, 2004).
Menurut American Pre-veterinary medical association (APVMA) (2004)
tingkat presisi yang sebaiknya dipenuhi berdasarkan konsentrasi analit yang dianalisis
dapat dilihat pada tabel dibawah ini:

Jumlah komponen terukur dalam sampel Tingkat presisi (y)

 X 10,00 % y 2%
1,00% x 10,00 % y 2%
0,10% x 1,00% y 10%
X 0,10% y 20%

2. Tujuan
Uji presisi dilakukan untuk mengetahui kedekatan atau kesesuaian antara hasil
uji yang satu dengan yang lainnya pada serangkaian pengujian presisi hasil pengkuran
digambarkan dalam bentuk persentase Relative Standart Deviation (%RSD).
 SELEKTIFITAS (SPESIFISITAS)
1. Definisi
Selektivitas adalah kemampuan yang hanya mengukur zat tertentu saja secara
cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks
sampel. Selektivitas sering kali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan
(degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan
yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing
lainnya dan dibandingkan terhadap hasil analis yang tidak mengandung bahan lain
yang ditambahkan (Harmita, 2004).
Metode selektivitas ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel
yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau
pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi.
Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya (Harmit,
2004).
Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh,
maka selektifitas dapat ditujukan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung
cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan
dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisa
kelarutan fase, dan Differential Scanning Colorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil
analisis tersebut merupakan ukuran selektifitas. Pada metode analisis yang
melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya
resolusinya (Rs) (Harmita, 2004).
ICH membagi spesifisitas dalam 2 kategori, yaitu uji identifikasi dan uji
spesifitas ditunjukkan dengan kemurnian atau pengkuran. Untuk tujuan identifikasi,
spesifisitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode analisis untuk
membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul hampir sama. Untuk
tujuan uji kemurnian dan tujuan pengukuran kadar, spesifitas ditunjukkan oleh daya
pisah 2 senyawa yang berdekatan (sebagaimana dalam kromatografi). Senyawa-
senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen aktif dan suatu
pengotor. Jika dalam suatu uji terdapat suatu oengotor (impurities) maka metode uji
harus tidak terpengaruh dengan adanya pengotor ini (Ginandjar dan Rohman, 2009).
Penentuan spesifisitas metode dapat diperoleh dengan 2 jalan. Pertama (paling
diharapkan) adalah dengan melalukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang
dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain (resolusi senyawa yang
dituju 2). Cara kedua, untuk memperoleh spesifisitas adalah dengan menggunakan
detekstor selektif, terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi secara bersama-
sama. Sebagai contoh, detektor elektrokimia atau detektor fluoresen hanya akan
mendeteksi senyawa tertentu, sementara senyawa lainnya tidak terdeteksi.
Penggunaan detektor UV pada panjang gelombang yan spesifik juga merupakan cara
yang efektif untuk melakukan pengukuran selektifitas (Gandjar dan Rohman, 2009).
 LINEARITAS DAN RENTANG

1. Definisi
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang meberikan respon yang
secara langsung atau dengan bantuan transformasi yang baik, prporsional terhadap
konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah
dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan,
keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (Harmita,2004).
Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi arah garis regresi yang
dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperolh dari hasil uji analit
dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakukan matematik dalam
pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat
terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Dalam beberapa kasusu,
untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan
konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui transformasi matematik dulu
sebelum dibuat analisis regresinya (Harmita, 2004).
Dalam praktek, digunakansatu seri larutan yang berbeda konsentrasiya antara
50 150% kadar analit dan sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang
konsentrasi yang digunakan antara 0 200%. Jumlah sampel yang dianalisis
sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko. Sebagai parameter adanya
hubungan linear digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi Y = a + bX.
Hubungan linear yang ideal dicapai jika nilai b + 0 dan r = +1 atau -1 bernatung pada
arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen
yang digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residul
(Sy) (Harmita, 2004).
Keterangan:
Dimana 1 = a + bx
Sy
Sx0 = b

Sx0 = standart deviasi dari fungsi

Sx 0
Vx0 = x

V x0 = koefisien variasi dari fungsi

(Harmita, 2004).
 BATAS DETEKSI DAN BATAS KUANTITASI

1. Definisi
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi
yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Batas
deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada
analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih
dapat memenuhi kriteria cermat dan eksama (harmita, 2004).
Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode
analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak
menggunakan instrumen batas tersebut ditsentukan dengan mendeteksi analit dalam
sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis intrumen batas deteksi dapat
dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku
respon blanko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan (Harmita,
2004).
Cara menentukan LOD dan LOQ ada 3 cara, yaitu:
1. Signal-to-noise
2. Penentuan blangko
3. Kurva kalibrasi

Dimana:
Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)
k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi
Sb = simpangan baku respon analitik dari blanko
Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap
konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y= ax + bx).
( Harmita,2004).
Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui regresi linear
dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis
linear y = a +bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku
residual (Sy/x).
1) Batas deteksi (Q)
Karena k = 3 atau 10
Simpangan baku (Sb) = Sy/x, maka
3 Sy / x
Q= S1

2) Batas kuantitasi (Q)

310 Sy / x
Q= S1

(Harmita, 2004).
 KETANGGUHAN METODE
1. Definisi
Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari
analisis sampel yang sama dlam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium,
analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll. Ketangguhan
biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau
lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan
pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis (Harmita, 2004).
Ketangguhan metode ditentukan dengan menganalisis beningan suatu lot
sampel yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analis yang berbeda
menggunakan kondisi operasi yang berbeda, dan lingkungan yang berbeda tetapi
menggunakan prosedur dan parameter uji yang sama. Derajat ketertiruan hasil uji
kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel penentuan. Ketertiruan dapat
dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah kondisi normal utuk
mendapatkan ukuran ketangguhan metode. Perhitungannya dilakukan secara statistik
ANOVA (Harmita, 2004).
 KEKUATAN METODE
1. Definisi
Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi
yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan
akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan
prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik
fase gerak (1%), pH fase gerak ( 0,2 unit), dan perubahan temperatur kolom (2-
3oC). Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium (Harmita,
2004).
 PENDEKATAN METODE VALIDASI

Ada beberapa pendektan untuk melakukan metode validasi, yaitu :

a. Metode speaking buta nol
Pendekatan metode speaking buta nol melibatkan analisis tunggal
menggunakan suatu metode yang akan divalidasi untuk melakukan analisis
suatu sampel yang mengandung level analit tertentu yang sudah diketahui
 DAFTAR PUSTAKA
http://farmasiindustri.com/wp-
content/uploads/2016/03/validasi_dan_verifikasi_metode.pdf?x83221
BUKU VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE UJI
http://chemistry.uii.ac.id/BUKU%20PAK%20RI/2.%20Buku%20Validasi
%20Metode%20ok.pdf