VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE

ANALISIS SEDIAAN FARMASI DI

LABORATORIUM PENGUJIAN MUTU
(INDUSTRI DAN PEMERINTAHAN)

Hilda Aprilia, M.Si, Apt.

KBK Kimia Farmasi
Prodi Farmasi UNISBA

VALIDASI DALAM AL-QURAN

Hai orang-orang yang beriman, jika datang

kepadamu orang fasik membawa suatu berita,
maka periksalah dengan teliti, agar kamu tidak
menimpakan suatu musibah kepada suatu kaum
tanpa mengetahui keadaannya yang menyebabkan
kamu menyesal atas perbuatanmu itu.
(QS. Al Hujuraat : 6)

Pendahuluan
Metode-metode analisis yang digunakan di
laboratorium pengujian (industri farmasi,
pemerintahan) harus secara rutin
dikembangkan atau dimodifikasi untuk
memperoleh metode analisis yang lebih
baik dan mutakhir.
Pengembangan metode tidak dapat
dipisahkan dari validasi metode analisis,
karena metode analisis hasil
pengembangan tersebut baru dapat
dikatakan baik, kalau dapat divalidasi
secara ilmiah kesesuaiannya dengan
tujuan pengembangan metode tersebut.

Desain
Rasional

Kemanan
dan khasiat

Penemu
an

-Riset dasar
- Skreening
-Uji pada
hewan

Kualitas

Pengemban
gan

Uji
praklinik
-

- Uji klinik

GLP &
GCP

Manufaktur
senyawa
Aktif

Produksi
senyawa
aktif

GMP

Kualitas

Manufak
tur obat
jadi

Produksi
sediaan
jadi

GMP

Perjalanan obat baru

Kualitas

Pemasara
n,
Penjualan
dan
Pengguna
an
-Promosi
- Distribusi
- Layanan
Komunikas
i

GDP &
GPP

PROSES PENGEMBANGAN SEDIAAN

RISET
FARMASI
PENEMUAN
OBAT

CALO
N
OBAT

PENGEM
BANGAN
FORMUL
A

PENGEMBAN
GAN
METODE
ANALISIS
AWAL

FAS
EI

FASE
II

OPTIM
ASI
FORMU
LA

UJI
STABILIT
AS

METODE
ANALISI
S UNTUK
FORMUL
A

FINALIS
ASI
METODE
ANALISI
S

FASE
III

VALIDASI
PROSES
MANUFAKT
UR

VALIDA
SI
METOD
E
ANALIS
IS

PAS
EN

MARKET

MANUFAK
TURING

PENGAWA
SAN MUTU

Laboratorium Pengujian dan Pengawasan Mutu

Pengawasan mutu merupakan bagian penting dari

kegiatan industri (CPOB ) dan kegiatan pemerintah
dalam pengawasan/pengendalian sediaan farmasi,
kosmetika dan pangan.
Salah satu bagian integral dari sistem mutu adalah
pengawasan mutu, meliputi sampling, penanganan
sampel, spesifikasi, pengujian, pelaporan dan
dokumentasi.
Dalam pelaksanaan pengujian mutu sebaiknya
digunakan metode yang sesuai. Biasanya
digunakan metode standard. Metode non-standard
dapat digunakan jika metode standard tidak
tersedia dan pelanggan menyetujui
penggunaannya.

Persyaratan Umum Laboratorium

Pengujian Mutu
Fasilitas dan instrumen analitik yang
memadai (terkalibrasi dan terjaga
kebersihannya )
Personal yang terlatih (qualified and
trained personal)
Metode/Prosedur pengujian yang sudah
divalidasi atau diverifikasi serta tersedia di
laboratorium
Sistem Dokumentasi dan Rekaman yang
baik
Tersedianya Mutu Baku atau Spesifikasi
yang digunakan

Tahapan analisis kimia

Proses validasi
Validasi adalah suatu proses yang dilakukan sekurang-kurangnya 4
tahap :
A.
B.
C.
D.

Validasi perangkat keras

Validasi perangkat lunak
Uji Kesesuaian sistem
Validasi metode
(1) Perangkat
keras

(4) Validasi metode

VALIDASI
(2) Perangkat
lunak

(3) Kesesuaian
sistem

Proses diawali dengan menggunakan perangkat dan sistem

yang telah dikualifikasi. Validasi metode dilakukan dengan
menggunakan sistem yang sudah dikualifikasi dan pengujian
kesesuaian sistem. Masing-masing tahap sangat menentukan
bagi keberhasilan proses validasi

Validasi/verfikasi metode wajib dilakukan

dengan berbagai alasan antara lain untuk:
1. Menjamin mutu dan pencapaian tingkat mutu
tertentu
2. Menjamin mutu produk yang dapat diterima
oleh suatu badan internasional
3. Memenuhi persyaratan akreditasi ISO 17025
4. Memenuhi persyaratan pendaftaran obat
jadi/sediaan farmasi
5. Memenuhi persyaratan metode yang
digunakan pada uji profisiensi

Validasi/Verifikasi Metode
Farmakope, ISO 17025.2005 dan CPOB mensyaratkan bahwa
metode pengujian yang digunakan untuk menetapkan mutu
produk farmasi dan pemenuhan persyaratan mutu/spesifikasi,
harus sudah dibuktikan kesesuaiannya terhadap akurasi,
presisi dan reliabilitasnya yang telah ditetapkan.
Para pengguna metode standard, misalnya yang terdapat
dalam kompendia (farmakope dan kodeks) tidak disyaratkan
untuk memvalidasinya tetapi diwajibkan untuk memverifikasi
kesesuaian metode itu pada kondisi penggunaan.
Metode pengujian yang non-standard atau hasil
pengembangan laboratorium sebelum digunakan harus
divalidasi dahulu.
Kegiatan validasi/verifikasi metode merupakan kegiatan yang
terencana dan dilakukan oleh personal yang terlatih.

Laboratorium harus memvalidasi:

a. Metode tidak baku (non-standard)

b. Metode yang didisain/dikembangkan
sendiri.
c. Metode standard yang digunakan di
luar lingkup yang dimaksudkan.
d. Metode standard yang dimodifikasi
atau direvisi untuk mengkonfirmasi
bahwa metode itu sesuai untuk
penggunaan yang dimaksudkan.
(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.2)

 Validasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah

yang dilakukan untuk membuktikan bahwa
karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi
persyaratan yang sesuai dengan tujuan
pengunaannya. Atau konfirmasi melalui pengujian dan
pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan
tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi.
(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.1)
Verifikasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah
yang dilakukan laboratorium untuk membuktikan
bahwa laboratorium mampu menggunakan metode
analisis standar sesuai dengan tujuan penggunaannya
pada kondisi nyata laboratorium.
Karakteristik kinerja metode (parameter
validasi/verifikasi) yang dibuktikan harus berdasarkan
pada tujuan kegunaan, kategori dan kriteria
metode tersebut.

KRITERIA METODE ANALISIS I

KADA
R
BESAR

SPESIFIK/SEL
EKTIF

KADAR
KECIL

SPESIFIK/SELE
KTIF
SENSITIF

ANALISIS
KUALITATI
F

KRITERIA METODE ANALISIS

II

KADA
R
BESAR

SPESIFIK/SELEK
TIF
AKURAT
PRESISI

ANALISIS
KUANTITA
TIF
KADAR
KECIL

SPESIFIK/SELEK
TIF
SENSITIF
AKURAT
PRESISI

Kategori metode analisis (USP)

Kategori I
Metode analisis untuk penetapan kadar
komponen utama dalam bahan baku obat atau
bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk
farmasi
Kategori II
Metode analisis untuk penetapan cemaran atau
hasil degradasi dalam bahan baku obat atau
produk farmasi. Metode ini terdiri dari penetapan
kuantitatif (II a) dan uji batas/kualitatif (II b)
Kategori III
Metode analisis untuk penetapan karakteristik
sediaan (disolusi, pelepasan obat, dll)
Kategori IV
Metode analisis untuk identifikasi

Kategori Metode Analisis (FDA)

Kategori I (Quantitative Assessment of Major
Component), meliputi Penetapan kadar senyawa
aktif dalam bahan baku dan sediaan farmasi, uji
keseragaman kandungan (uniformity content), uji
disolusi/pelepasan obat.
Kategori II a (Quantitative Assessment of Minor
Component) meliputi penetapan kadar cemaran
dan hasil degradasi dalam bahan baku dan
sediaan farmasi termasuk kadar obat dalam
darah.
Kategori II b (Qualitative Assessment of Minor
Component) meliputi uji kualitatif dan uji batas
cemaran dan hasil degradasi dalam bahan baku
atau sediaan farmasi)

Parameter yang digunakan dalam validasi

metode analisis
USP
(United States Pharmacopeia)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Presisi (keseksamaan)
Akurasi (kecermatan)
Batas deteksi
Batas kuantitasi
Spesifisitas (kekhasan)
Linearitas
Rentang

ICH
(International Conference on
Harmonization)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Presisi
Akurasi
Batas deteksi
Batas kuantitasi
Spesifitas
Linearitas
Rentang
Robustness
Kesesuaian sistem

Presisi
Akurasi

Rentang

Linearitas

Batas deteksi dan

kuantitasi

Spesifisitas

Ketegaran/
Robustness

Calon metode analisis

Metode telah divalidasi/verifikasi

Prosedur pengawasan mutu

Hakikat Pengujian Validasi/Verifikasi

PARAMETER VALIDASI

1. Spesifisitas/Selektifitas

PEMBUKTIAN UNTUK
MENGUJI
Adanya gangguan

(interferences) dari
senyawa lain, cemaran,
hasil degradasi atau
matriks.
2. Batas Deteksi dan
Kuantitasi
3. Akurasi

Kepekaan
a. Galat sistematik (bias)

b. Rekoveri (Recovery)
c. Linearitas
4. Presisi

a. Galat acak
b. Keterulangan
(Repeatability)
c. Presisi antara

Strategi Validasi/Verifikasi Metode Analisis

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Nyatakan dengan jelas tujuan dan ruang lingkup

dari metode yang akan divalidasi/verifikasi
Tentukan parameter kinerja metode dan
kriteria penerimaan untuk masing-masing
parameter tsb.
Buat rencana percobaan validasi/verifikasi
Verifikasi kinerja dan Kalibrasi semua peralatan
dan instrumen
Siapkan semua bahan seperti pereaksi, pelarut
dan bahan acuan standar (BPFI, CRM, SRM),
matriks dll.
Lakukan percobaan validasi/verifikasi secara
internal ataupun eksternal
Buat SOP pelaksanaan validasi/verifikasi metode
untuk kegiatan pengujian rutin (method
transferred)
Buat kriteria untuk revalidasi
Buat laporan dan dokumentasi lengkap

Panduan validasi metode analisis

Badan
ICH

Judul panduan
a.

b.
CDER

a.
b.
c.
d.

USP

Tahun
terbit

ICH Q2A : Text on validation of

analytical
Procedure
ICH Q2B Validation of analytical
procedures methodology

1994

Reviewer guidance validation of

chromatographic methods
Submitting sample and analytical
data for method validation
Analytical procedure and method
validation for human studies
Bioanalytical method validation for
human studies

1994

Validation of compendial method

1995

1987
2000
1999
2009

Tahapan validasi metode

1, Tahap persiapan

Kalibrasi instrumen dan alat-alat gelas

Penyiapan pereaksi pelarut dan bahan acuan
baku (CRM, SRM, BPFI) serta matriks sediaan
(placebo)
Uji kesesuaian sistem untuk metode
kromatografi

2, Tahap validasi

Spesifisitas
Linieritas dan rentang
Batas deteksi
Batas kuantisasi
Akurasi
Presisi

SPESIFISITAS
Kemampuan untuk menguji secara tegas analit
yang dimaksud dengan adanya komponen lain
atau yang diperkirakan ada seperti cemaran, hasil
degradasi dan komponen matriks.
Jika spesifisitas metode tidak ada atau kurang baik maka
metode dapat dilengkapi dengan prosedur analisis
pendukung yang memadai seperti pemisahan : ekstraksi,
destilasi, SPE, dll
Pengujian
a. Untuk identifikasi senyawa aktif dalam bahan atau
sediaan.
Metode harus mampu menyeleksi dan mengidentifikasi
senyawa-senyawa yang ada dalam sampel yang
berkaitan dengan struktur molekulnya. Dapat dibuktikan
dengan hasil positif (atau dibandingkan dengan bahan
acuan standar yang diketahui) dari sampel yang
mengandung analit dan dengan hasil negatif dari
sampel yang tidak mengandung analit.
b. Untuk penetapan kadar cemaran
Dilakukan dengan menguji sampel yang ditambahkan

c. Untuk penetapan kadar

Dinyatakan dengan jelas bahwa prosedur tidak
dipengaruhi oleh adanya cemaran atau
gangguan matriks. Dalam praktek dapat
dilakukan dengan cara menguji sampel yang
ditambahkan sejumlah tertentu cemaran atau
matriks dan terlihat nyata bahwa prosedur tidak
dipengaruhi oleh komponen asing tersebut.
Jika cemaran tidak tersedia maka sampel yang
diuji harus diperlakukan sebelumnya dengan
menyimpan sampel dalam kondisi stress yang
relevan (cahaya, panas, kelembaban, hidrolisis
asam/basa oksidasi). Dalam kasus ini pengujian
dilakukan bersama sampel utuh.
Untuk metode kromatografi, dipersyaratkan
kromatogram harus ditampilkan untuk melihat
derajat selektivitasnya dan kemurnian pucak
(dengan PDAD atau MS detektor)

LINEARITAS
Kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang
proporsional (sepadan) terhadap konsentrasi analit
dalam sampel dan dalam rentang konsentrasi yang
digunakan secara langsung atau melalui suatu
transpormasi matematik yang jelas.
Pengujian:
Menyiapkan larutan analit sebanyak minimal 6
konsentrasi dengan rentang 20 - 120% dari konsentrasi
aktual
Mengukur respon instrumen ke enam larutan tersebut,
masing-masing paling sedikit tiga kali pengukuran
Buat kurva antara respon instrumen terhadap
konsentrasi analit dan hitung persamaan matematik
yang memadai (persamaan garis regresi linier atau
regresi kuadrat)
Hitung derajat linearitas melalui:
- koefisien korelasi (r)
- Vxo
- % Y-intercept
- faktor respon

Kurva kalibrasi:

Respon alat

a.
b.

C
d.

konsentrasi

Y = bx + a (dapat dihitung dengan kalkulator)

b = kemiringan garis regresi
a = perpotongan garis dengan sumbu Y (dapat dihitung dengan kalkulator)
r = koefisien korelasi

( xi xbaku
)( yi residu
y ) dari regresi linear
Sy/x= simpangan
{( xi x ) 2 ( y 1 y ) 2 }1/ 2

yi yi ) 2

Vxo = koefisien variansi regresi linear

n2

Vxo

Sy/x
bx

100%

1/ 2

Persamaan regresi kuadratik

a. Y = mx2 + nx + b
dimana y = respon instrumen, x = konsentrasi analit, n,m,b = fungsi kuadratik
b.

yi b. yi m ( xi yi ) n ( xi . yi )
2

c.

d.

Sy/x

n3

E m 2 nx
Vxo

Sy/ x
E.x

100%

Parameter Vxo inilah yang dijadikan dasar untuk pemilihan kurva

kalibrasi yang menggunakan regresi linear atau regresi kuadratik
dengan memilih Vxo yang paling mendekati 2%

Kriteria penerimaan linearitas dan rentang

Metode

Untuk

Level

Rentang

Kriteria penerimaan*)

Penetapan kadar

50 - 150 %
20 - 120 %

r>0,999
%y- intercept<2,0%
Vxo<2,0 %

Disolusi

5-8

10% 150 % dari Q

**)

r>0,99
%y intercept <5,0%
Vxo<5,0 %

Cemaran (Kadar
rendah)

LOQ - 2 %

r>0,98
Vxo<5,0%

Cleaning ( Kadar
sangat rendah)

LOQ 20 kali LOQ

r>0,98
Vxo<5,0%

*) Dari : Handbook of Pharmaceutical by HPLC

**) Q Persentasi jumlah zat terlarut dalam medium

RENTANG
Rentang adalah interval antara batas terendah dan batas
tertinggi konsentrasi analit yang telah dibuktikan dengan
hasil presisi, akurasi dan linearitas yang dapat diterima.
Rentang metode diuji dengan melakukan pembuktian data yang
memperlihatkan presisi, akurasi dan linieritas yang dapat diterima,
baik pada konsentrasi terendah dan maupun tertinggi serta pada
konsentrasi lain dalam rentang sesuai dengan tujuan metode analisis
Rentang dinamik : Linearitas,
Akurasi dan Presisi

Respon

*
*

Batas terendah
(LOQ)

Batas tertinggi
(ULL)
konsentrasi

Presisi pada Batas

Terendah (LOQ) : RSD <
20 %
Titik yang lain antara
Batas terendah sampai
Batas tertinggi: RSD <
15%

BATAS DETEKSI DAN BATAS KUANTISASI

a.

Batas deteksi (BD)

Konsentrasi terendah analit dalam sampel yang
masih dapat terdeteksi, tapi tidak perlu ditetapkan
secara kuantitatif dalam kondisi percobaan yang
telah dinyatakan

Pengujian
1. Untuk metode non instrumen, BD ditetapkan
dengan
menguji sampel yang mengandung analit
dalam kadar
tertentu. Dengan melakukan pengenceran secara
bertahap, ditentukan batas terendah kadar analit yang
masih
dapat dideteksi secara visual (menggunakan reaksi
kimia,
KLT,dll)

2. Untuk metode instrumen, BD dinyatakan:

a. Sebagai konsentrasi analit pada saat respon
menunjukkan ratio signal-noise 3 : 1 (S/N = 3).
b. Mengukur besarnya respon instrumen dari 20
larutan blangko dan menghitung simpangan
bakunya (SD). Batas deteksi merupakan hasil
perkalian simpangan baku blangko dengan suatu
faktor (3,3/b), di mana b merupakan kemiringan
garis regresi linier.
Perhitungan
-. BD = Konsentrasi larutan pada S/N 3
= 3 [Konsentrasi larutan uji/(S/N)]
-. BD = 3,3 (SD/b) = 3,3 (Sy/x )/b
dimana SD = simpangan baku blangko (n = 20)
b = kemiringan garis regresi (Y = bX + a)

Catatan:
SD (simpangan baku) dapat dihitung dengan
cara menghitung :
a. Simpangan baku larutan blangko
b. Simpangan baku residual garis regresi (Sy/x)
c. Simpangan baku pada perpotongan garis
sumbu Y ( Y-intercept).
Dengan demikian BD dapat diprediksi dari hasil
pengukuran larutan blangko, hasil perhitungan
dari data pengukuran larutan encer, atau dari
data kurva kalibrasi (persamaan regresi linier).

b. Batas kuantisasi (BK)

Batas kuantisasi (BK) adalah konsentrasi terrendah

analit dalam sampel yang dapat ditentukan dengan
presisi dan akurasi yang diterima dalam kondisi
percobaan yang ditetapkan. BD dan BK dinyatakan
dalam satuan konsentrasi.
Suatu karakteristik metode penetapan kadar senyawa
kadar rendah dalam matriks sampel seperti cemaran dan
hasil degradasi dalam bahan baku obat atau sediaan
farmasi.

Pengujian
1. Untuk metode non instrumental, umumnya ditentukan
dengan
melakukan analisis sampel yang mengandung
analit, lalu
menetapkan kadar terendah analit yang dapat
dideteksi
dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima.

2. Untuk metode instrumental, umumnya

dengan mengukur besarnya respon latar
belakang analisis dengan cara menganalisis
sejumlah larutan blangko sampel dan
menghitung simpangan bakunya. Batas
Kuantitasi (BK) adalah nilai simpangan baku
larutan blangko (SD) dikalikan faktor (10/b).
Untuk pengukuran respon instrumen yang
memberikan latar belakang (noise), maka batas
kuantitasi adalah konsentrasi analit dalam
larutan di mana respon instrumen memberikan
ratio signal-noise (S/N) =10

Perhitungan:
- BK = Konsentrasi analit pada S/N 10
= 10 [Konsentrasi larutan]/(S/N)]
- BK = 10 (SD/b) = 10 (Sy/x)/b)
di mana b = kemiringan garis regresi,
SD = simpangan baku blangko
Sy/x = simpangan baku residual garis regresi

Cara lain:
Penentuan Batas kuantisasi adalah konsentrasi
larutan yang menunjukkan simpangan baku relatif
20% terhadap nilai teoritis.

AKURASI (KECERMATAN)

Akurasi adalah tingkat kedekatan hasil pengujian

metode dengan nilai yang sebenarnya atau nilai
yang dinyatakan benar

Pengujian

Akurasi ditentukan dengan 4 cara sebagai persen

perolehan kembali (rekoveri /recovery)
a. Analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi
terhadap sampel yang telah diketahui kadarnya.
Sampel yang digunakan adalah sampel acuan baku yang
dikeluarkan badan resmi ( SRM dari NIST, dll.).
b. Analisis kadar analit yang ditambahkan ke dalam
matriks sampe (plasebo)yang dianalisis (spiked method).
c. Jika matriks dan eksipien tidak tersedia, maka akurasi
dnyatakan sebagai persen perolehan kembali kadar
analit yang ditambahlkan pada produk jadi yang sudah
mengandung analit (standar addition method).
d. Membandingkan hasil analisis analit dengan metode
yang divalidasi terhadap hasil dengan metode baku (cara
grafik).

Kriteria penerimaan akurasi *)

Jenis uji

Level
konsentrasi

Rentang

Kriteria

Penetapan kadar
3 level, dengan 3
dalam bahan baku kali pengujian
atau sediaan jadi

70%, 100%, 130 %

(80%, 100%,
120%)

Bias : + 2%
Rekoveri:
98,0 102,0%

Disolusi

3 level dengan 3
kali pengujian

20 35 % Q
50 80 % Q
100 130 % Q

Bias : + 5%
Rekoveri:
95,0 105,0 %

Penetapan kadar
Rendah
(Cemaran)

1 level dengan 3
kali pengujian

LOQ 1%

Bias : + 20,0%
Rekoveri:
80,0 120,0 %

Penetapan Kadar
sangat rendah
(Cleaning)

3 level dengan 3
kali pengujian

LOQ 20 kali LOQ

Bias : + 50,0%
Rekoveri:
50,0 150,0 %)

*) Handbook of Pharmaceutical analysis by HPLC

**) Q Persen terdisolusi

Perhitungan
1. Spiked placebo recovery
% Rec = Ch/Cs x 100%
Ch = kadar analit yang dihitung
Cs = kadar analit teoritis
2. Standard addition method
Ch = {(R2 R1)/R1}x C
% Rec = {Ch/Ca} x 100
Ch = Analit baku (SRM) yang ditambahkan pada produk jadi,
C = kadar analit dalam sampel produk jadi, R 2, R1 = respon
R1 oleh sampel produk jadi dan R2 respon sampel yang telah
ditambah analit baku,
Ca = kadar analit yang sebenarnya ditambahkan

3.

No.

1
2
3
4
5
6

Multiple Standard Addition

Sampel Penambah Kadar

an baku
temua
n
So
S1
S2
S3
S4
S5

B
C
D
E
F

Kadar
sebenarny
a

% Recovery
(x 100)

A
A1

B1 = A1-A

B1/B

A2

C1 = A2-A

C1/C

A3

D1 = A3-A

D1/D

A4

E1 = A4-A

E1/E

A5

F1 = A5-A

F1/F

Akurasi intrinsik

PRESISI (KESEKSAMAAN)
Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil
analisis individual jika prosedur dilakukan berulang
kali terhadap sampel ganda atau beberapa sampel
yang homogen.
Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan
baku relatif (SBR) atau koefisien variasi (KV). Presisi metode
dinyatakan dengan tiga jenis penetapan yaitu
repeatabilitas (keterulangan), presisi antara dan
reprodusibilitas (ketertiruan)
a. Repeatability (keterulangan)
Keterulangan adalah kemampuan metode untuk
memberikan hasil analisis yang sama untuk
beberapa sampel yang kadarnya sama yang
dilakukan oleh satu orang analis pada wakt tertentu
terhadap beberapa sampel yang sama.
Keterulangan diukur terhadap 6 jenis sampel dengan
konsentrasi sama 100% dari konsentrasi aktual atau 3
jenis sampel dengan konsentrasi 80, 100, 120% dari
konsentrasi aktual yang diukur masing-masing tiga kali
(triplikasi).

b.

c.

d.

Presisi antara (intermediate precision)

Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode dimana
sampel-sampel diuji dan dibandingkan menggunakan tenaga
analis berbeda, perlatan berbeda atau hari berbeda (inter day
precision).
Presisi antara tidak perlu diuji , jika kajian reprodusibilitas
telah dilakukan. Nama lain presisi antara adalah Ruggedness
Reprodusibilitas (ketertiruan)
Merupakan pengujian presisi yang terakhir dan tuntas.
Reprodusibilitas diuji dengan cara menyiapkan sampel yang
homogen dan stabil, lalu diuji oleh beberapa laboratorium
(studi kolaboratif). Hail ini akan memperlihatkan adanya galat
acak yang disebabkan oleh sampel dan laboratorium , serta
galat sistematik. Dihitung dengan ANOVA
Presisi sistem atau instrumen
Keragaman dalam pengukuran menggunakan suatu instrumen
akan memberikan kontribusi pada presisi sistem. Oleh karena
itu sistem yang digunakan harus diuji kesesuaiannya meliputi
misalnya keterulangan penyuntikan, resolusi, kesimetrisan
pada Kromatografi

Berbagai tingkat presisi dan

kontribusinya pada hasil analisis

Kriteria penerimaan presisi *)

Repeatabilitas dan presisi antara
Jenis Pengujian

Level dan
Rentang konsentrasi

Kriteria
penerimaan

Penetapan
kadar/keseragaman
kandungan

3 level dengan 3 kali

(70, 100, 130%)
atau
6 penetapan pada
100%

RSD < 2,0%

Disolusi

12 sampel kadar
rendah

RSD < 20%

Penetapan kadar
Rendah (Cemaran)

6 replika pada LOQ

RSD < 20,0%
dari batas toleransinya

Cleaning

6 replikat pada 10 LOQ RSD < 20,0%

*) Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC

Dasar Perhitungan Presisi

RSD

2
(
x

x
)
i

SD
x

SD
100%
x

n 1

Presisi dapat diperoleh dengan

menggunakan sampel otentik yaitu sampel
yang dibuat dengan mencampurkan analit
(bahan acuan) dengan matriks atau
plasebo.
Parameter yang dipergunakan untuk
menyatakan presisi adalah simpangan baku
(SD) , simpangan baku relatif (SBR atau
RSD), koefisien variasi (KV), dan batas

KURVA TEROMPET HORWITZ

Nilai simpangan baku relatif atau disebut juga
koefisien variasi (SBR, RSD, KV ) akan meningkat
dengan menurunnya konsentrasi analit. HORWITZ
telah melakukan kajian terhadap 3000 hasil analisis
yang diambil dari studi kolaboratif AOAC dan
memberikan hasil sebagai berikut :
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)
Dimana C adalah konsentrasi yang dinyatakan
sebagai fraksi desimal
Misalnya : Untuk kadar C = 100%
maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%

 Hubungan RSD terhadap C digambarkan sebagai

kurva berupa terompet. Oleh karena itu kurva
tersebut dinamakan kurva terompet
HORWITZ
Jika nilai RSD dari percobaan dibandingkan
terhadap RSD yang dihitung dari persamaan
terompet HORWITZ akan diperoleh HORWITZ
RATIO atau HORRAT:
HORRAT = SBRobs/SBRcalc
Jika nilai HORRAT <2 menandakan metode
analisis mempunyai presisi yang memadai

Harga RSD yang dihitung dari

persamaan HORWITZ
Konsentrasi
relatif

RSD
(%)

100 (100%)
10-1 (10%)
10-2 (1%)
10-3 (0,1 %)
10-4
10-5
10-6 (ppm)
10-7
10-8
10-9 (ppb)
10-10
10-11
10-12 (ppt)

2,00
2,83
4,00
5,66
8,00
11,31
16,00
22,63
32,00
45,25
64,00
90,51
128,00

Kurva Terompet HORWITZ

ROBUSTNESS (KETEGARAN METODE)

Ukuran kemampuan metode untuk tetap tak
terpengaruh dan bertahan terhadap pengaruh kecil,
yang dilakukan dengan sengaja dengan membuat
variasi pada faktor yang berpengaruh, tetapi
memberikan indikasi reliabilitas metode yang normal
pada pengujian biasa.
Robustness sebenarnya harus dan dapat diuji pada saat
pengembangan metode.

Tahapan Uji :
a.
b.
c.
d.
e.

Identifikasi faktor-faktor yang berpengaruh pada pengujian

Menentukan level dari faktor-faktor tersebut
Seleksi dan disain percobaan
Pelaksanaan percobaan
Perhitungan pengaruh faktor terhadap hasil analisis
(menggunakan statistika- teknik ANOVA)

TAHAPAN PELAKSANAAN VALIDASI

Dengan asumsi semua bahan yang digunakan dalam
validasi/verifikasi
sudah siap, maka tahapan validasi metode dapat diuraikan
sebagai
berikut :
1.

2.

3.
4.

5.

Hari pertama, Pengujian linearitas menggunakan paling

sedikit 6 level konsentrasi (untuk bahan baku obat maupun
sediaan farmasi). Penetapan kadar analit dalam bahan baku
obat maupun sediaan farmasi.
Pada akhir hari 1: Penetapan kadar analit dalam 6 sampel
kadar sama yang homogen atau 3 sampel kadar berbeda (80,
100 dan 120%) untuk penetapan akurasi dan presisi.
Hari ke 2 dan 3 : Pengujian presisi antar hari (inter day
precision).
Hari ke 4: Penetapan batas kuantisasi dan batas deteksi
serta pengulangan penetapan presisi (bila diperlukan ) karena
LOQ dapat dihitung dari data uji linearitas melalui nilai S y/x dan
kemiringan garis regresi (b)
Hari ke 5 : Evaluasi dan pembuatan dokumen/laporan validasi.

Kriteria penerimaan pada validasi metode analisis kategori I

Parameter
validasi

Kriteria penerimaan

1. Spesifikasi
(metode
kromatografi)

a. Pada kromatogram hasil penyuntikan larutan analit

encer dan blangko/placebo tidak terdapat puncak lain
yang menggangu di waktu retensi analit
b. Puncak analit target terpisah dengan jelas dari puncak
yang lain
c. Puncak analit target murni berdasarkan detektor PDA
pada kondisi degradasi buatan

2. Linieritas

Kriteria ini berlaku untuk minimal 6 titik konsentrasi

antara
20-120% dari konsentrasi target :
a. Koefisien korelasi (r) tidak kurang dari 0,995
b. Persen bias dari y-intersept tidak kurang dari 5,0%
dan tidak lebih dari +5,0%
c. Vx0 < 2.0%

3. Rentang

Keseksamaan, kecermatan harus sesuai pada kadar 80%

sampai 120% kadar sampel

Parameter
Validasi

Kriteria Penerimaan

4. Kecermatan
(akurasi)

Rata-rata rekoveri masing-masing analit harus tidak kurang

dari 98% dan tidak lebih dari 102,0% untuk tiga kali
penetapan pada kadar analit 80, 100 dan 120% dari kadar
target

5. a.Presisi
b. Presisi
antara
(Intermediate
precision)

Simpangan baku relatif (SBR) dari enam kali

penetapan/penyuntikan atau dari 9 kali penetapan (3 kali
dari 3 konsentrasi) tidak lebih dari 2%
Simpangan baku relatif dari penetapan oleh dua analit, dua
instrumen atau 2 hari yang berbeda tidak lebih dari 2 %

6. Stabilitas analit

a. Hasil penetapan kadar dari sampel yang disiapkan tidak

berubah lebih dari 2% pada periode waktu yang
ditetapkan
b. Hasil penetapan kadar dari larutan baku kerja tidak
berubah lebih dari 2% pada perode waktu yang ditetapkan

7. Ketegaran
metode
(Robustness)

Kriteria

kesesuaian sistem harus dipenuhi untuk variasi

percobaan berikut :
- Komponen organik dalam fase gerak +5%
- konsentrasi pereaksi pasangan ion + 10%
- pH fase gerak +0,1 unit pH, laju alir + 10%, detektor + 2
nm, suhu kolom + 5%

Pustaka
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Satiadarma K., et al., Asas pengembangan

prosedur analisis, Cet.1, Airlangga University Press,
2004.
Swartz ME and Krull IS., Analytical method
development and validation, Marcel Dekker Inc.,
1997
Riley CM and Rosanske TW., Development and
Validation of Analytical Methods, Pergamon,
1996
Burges C., Valid analytical methods and
procdures, Royal Society of Chemistry,
Ermer J and Miller JH McB., Method validation in
Pharmaceutical Analysis., Wiley-VCH, 2005
Miller JC and Miller JN., Statistics for analytical
chemistry, 3rd ed., Ellis Horwood PTR Prentice Hall,
1994
Ahuja S and Dong MW., Handbook of
pharmaceutical analysis by HPLC, Elsevier Inc.,
2005
Kazakevich Y and Lobrutto R., HPLC for
pharmaceutical scientists., Wiley- Interscience,
2007

Terima kasih

atas perhatian saudara