FAKULTAS

FARMASI
UNIVERSITAS
ANDALAS

Analisis
Fisikokimia
VALIDASI

METODE
ANALISIS
Harrizul Rivai

PENDAHULUAN
Validasi metode analisis adalah proses pengujian
karakter kinerja metode analisis melalui serangkaian uji
laboratorium.
Tujuan: untuk menjamin bahwa metode analisis yang
digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan
handal hingga dapat dipercaya.
Parameter validasi metode analisis yang harus diuji:
1.Kecermatan (akurasi)
2.Keseksamaan (presisi)
3.Selektivitas (Spesifisitas)
4.Linearitas dan rentang
5.Batas deteksi dan batas kuantitasi
6.Ketangguhan metode (Ruggedness)
7.Kekuatan (Robustness)

KECERMATAN
(ACCURACY)
Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya.
Cara penentuan kecermatan:
1. Metode simulasi (spiked-placebo recovery): Analisis kadar analit
yang ditambahkan ke dalam matriks sampel (plasebo) yang
dianalisis
2. Metode penambahan baku (standard addition method): Jika
matriks dan eksipien tidak tersedia, maka akurasi dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali kadar analit yang
ditambahlkan pada produk jadi yang sudah mengandung analit.
3. Analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi terhadap
sampel yang telah diketahui kadarnya. Sampel yang digunakan
adalah sampel acuan baku yang dikeluarkan badan resmi
( SRM dari NIST, dll)
4. Membandingkan hasil analisis analit dengan metode yang
divalidasi terhadap hasil dengan metode standar (cara grafik)

KRITERIA PENERIMAAN AKURASI *)

Jenis uji

Level
konsentrasi

Rentang

Kriteria

Penetapan
kadar dalam
bahan baku
atau sediaan
jadi

3 level, dengan
3 kali pengujian

70%, 100%,
130 %
(80%, 100%,
120%)

Bias : + 2%
Rekoveri:
98,0 102,0%

Disolusi

3 level dengan 3 20 35 %
kali pengujian
50 80 %
100 130 %

Bias : + 5%
Rekoveri:
95,0 105,0 %

Penetapan
kadar Cemaran

1 level dengan 3 LOQ 1%

kali pengujian

Bias : + 20,0%
Rekoveri:
80,0 120,0 %

*) Handbook of Pharmaceutical analysis by HPLC

% RECOVERY YANG MASIH DAPAT DITERIMA TERGANTUNG

JUMLAH ANALIT DALAM MATRIKS CONTOH

No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Konsentrasi analit
dalam matriks contoh
100 %
10 %
1%
0.1 %
100 ppm
10 ppm
1 ppm
100 ppb
10 ppb
1 ppb

Rentang
% Recovery rata-rata
98 102
98 102
97 103
95 - 105
90 107
80 110
80 110
80 110
60 115
40 - 120

Perhitungan Recovery
1. Spiked placebo recovery
% Rec = Ch/Cs x 100%
Ch = kadar analit yang dihitung dari metode yang
divalidasi,
Cs = kadar analit teoritis
2. Standard addition method
Ch = {(R2 R1)/R1}x C
% Rec = {Ch/Ca} x 100
Ch = Analit baku (SRM) yang ditambahkan pada produk
jadi
C = kadar analit dalam sampel produk jadi
R2, R1 = respon R1 oleh sampel produk jadi, respon R2 oleh
sampel yang telah ditambah analit baku
Ca = kadar analit yang sebenarnya ditambahkan

KESEKSAMAAN (PRESISI)

Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil analisis

individual jika prosedur dilakukan berulang kali terhadap
sampel ganda atau beberapa sampel yang homogen
Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan
baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV).
Ada tiga jenis presisi, yaitu: repeatability (keterulangan),
presisi antara dan reprodusibilitas (ketertiruan)
a. Repeatability (keterulangan)
Keterulangan adalah kemampuan metode untuk memberikan
hasil analisis yang sama untuk beberapa sampel yang
kadarnya sama yang dilakukan oleh satu orang analis pada
waktu tertentu terhadap beberapa sampel yang sama
Keterulangan diukur terhadap 6 jenis sampel dengan
konsentrasi sama (100% dari konsentrasi aktual) atau 3 jenis
sampel dengan konsentrasi 80, 100, 120% dari konsentrasi
aktual yang ditetapkan masing-masing tiga kali (triplikasi)
(menurut ICH).

KESEKSAMAAN (PRESISI)
b. Presisi antara (intermediate precision)
Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode di mana
sampel-sampel diuji dan dibandingkan, dilakukan oleh analis
yang berbeda, menggunakan peralatan berbeda dan pada
hari yang berbeda. Presisi antara tidak perlu diuji jika kajian
reprodusibilitas telah dilakukan. Nama lain presisi antara
adalah Ruggedness
c. Reprodusibilitas (ketertiruan)
Uji ketertiriuan merupakan pengujian presisi yang terakhir
dan tuntas.
Reprodusibilitas diuji dengan cara menyiapkansampel yang
homogen dan stabil, lalu diuji oleh beberapa laboratorium
(studi kolaboratif). Hasil ini akan memperlihatkan adanya
galat acak yang disebabkan oleh sampel dan laboratorium,
serta galat sistematik. Datanya diolah dengan uji ANOVA
d. Presisi sistem atau instrumen
Keragaman dalam pengukuran menggunakan suatu
instrumen akan memberikan kontribusi pada presisi sistem.

Kriteria penerimaan presisi *)

Repeatabilitas dan presisi antara
Pengujian

Level dan
Rentang
konsentrasi

Kriteria

Penetapan
kadar/keseragama
n kandungan

3 level dengan 3
kali
(70, 100, 130%)
atau
6 penetapan pada
100%

RSD < 2,0%

Disolusi

12 sampel kadar
rendah

RSD < 20%

Penetapan kadar
6 replikat pada LOQ
*) Cemaran
Handbook of Pharmaceutical
Analysis
dan
batasby HPLC
toleransinya

RSD < 20,0%

Dasar Perhitungan Presisi

RSD

SD
100%
x

SD

2
( xi x )
n 1

xi
n

PRESISI DAPAT DIPEROLEH DENGAN MENGGUNAKAN

SAMPEL OTENTIK YAITU SAMPEL YANG DIBUAT DENGAN
MENCAMPURKAN ANALIT (BAHAN ACUAN) DENGAN
MATRIKS ATAU PLASEBO.
PARAMETER YANG DIPERGUNAKAN UNTUK
MENYATAKAN PRESISI ADALAH SIMPANGAN BAKU (SD) ,
SIMPANGAN BAKU RELATIF (SBR ATAU RSD), KEOFISIEN
VARIASI (KV).

KURVA TEROMPET HORWITZ

Nilai simpangan baku relatif atau disebut juga
koefisien variasi (SBR, RSD, KV ) akan meningkat
dengan menurunnya konsentrasi analit.
HORWITZ telah melakukan kajian terhadap 3000
hasil analisis yang diambil dari studi kolaboratif
AOAC dan memberikan hasil sebagai berikut :
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)
Di mana C adalah konsentrasi yang dinyatakan
sebagai fraksi desimal
Misalnya untuk kadar C = 100%, maka fraksi
desimalnya = 100/100 = 1
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%

 Hubungan RSD terhadap C digambarkan

sebagai kurva berupa terompet. Oleh karena
itu kurva tersebut dinamakan kurva
terompet HORWITZ
Jika nilai RSD dari percobaan dibandingkan
terhadap RSD yang dihitung dari persamaan
terompet HORWITZ akan diperoleh HORWITZ
RATIO atau HORRAT:
HORRAT = SBRobs/SBRcalc
Jika nilai HORRAT <2 menandakan metode
analisis mempunyai presisi yang memadai

Harga RSD yang dihitung dari persamaan HORWITZ

Konsentrasi relatif

RSD (%)

100 (100%)
10-1 (10%)
10-2 (1%)
10-3 (0,1 %)
10-4
10-5
10-6 (ppm)
10-7
10-8
10-9 (ppb)
10-10
10-11
10-12 (ppt)

2,00
2,83
4,00
5,66
8,00
11,31
16,00
22,63
32,00
45,25
64,00
90,51
128,00

Kurva Terompet HORWITZ

Selektivitas (Spesifisitas)