TUGAS PENGGANTI KULIAH VALIDASI METODE FKK B 2013

1. Validasi Metode Analisis adalah metode yang dilakukan untuk menjamin bahwa metode
analisis akurat, spesifik,reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis atau
suatu metode untuk menunjukkan bahwa semua metode tetap yang digunakan sesuai dengan
tujuan

penggunaannya

dan

selalu

memberikan

hasil

yang

dapat

dipercaya

(Gandjar,Rohman,2007)
Definisi validasi menurut SK Menkes RI No. 43/MENKES/SK/1998, tentang CPOB adalah
tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa bahan, prosedur, kegiatan, sistem,
perlengkapan atau mekanisme dalam produksi dan pengawasan senantiasa mencapai hasil
yang diinginkan (Anonim, 2007).

2. Validasi Metode Analisis dilakukan ketika :

- Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu
- Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena
munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus
-

direvisi
Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah

seiring dengan berjalannya waktu

Metode baku di gunakan dilaboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis

yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda

Untuk mendemostrasikan kesetaraan antara 2 metode, seperti antara metode baru
dan metode baku
(Gandjar,Rohman,2007).

3. Validasi Metode Analisis harus dilakukan karena untuk menjamin bahwa metode analisis
akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis, untuk
memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk
peruntukannya, dan untuk menjamin mutu suatu produk, penghematan biaya produksi (agar
tidak terjadi pekerjaan berulang), serta meningkatkan efektivitas produksi. Secara singkat
validasi merupakan aksi konfirmasi bahwa metode analisis yang akan digunakan sesuai
dengan tujuan yang diinginkan (Gandjar, Rohman, 2007).

4. Definisi Parameter Validasi Metode Analisis :

Spesifisitas
Spesifisitas adalah kemampuan metode uji untuk memberikan sinyal analitik dengan benar
untuk campuran analit dalam suatu sampel tanpa adanya interaksi antar analit. Spesifitas
seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang
dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan cemaran, hasil urai, senyawa sejenis,
atau senyawa asing lainnya dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang benarbenar murni.
Akurasi
Akurasi menunjukan derajat kedekatan hasil dari beberapa pengukuran yang diperoleh dari
contoh yang homogen pada kondisi tertentu. Ada 3 cara dalam metode ujinya, yaitu:

Uji Pungut Ulang (Recovery Test)

Pada prinsipnya, uji pungut ulang dapat dilakukan dengan menganalisis contoh yang
diperkaya dengan sejumlah kuantitatif analit yang akan ditetapkan. Jumlah absolut analit
yang diperoleh dari analisis ini dan jumlah serupa yang diperoleh dari pengujian yang sama
untuk contoh (tanpa penambahan analit) dapat digunakan untuk menentukan nilai pungut
ulang analit itu. Apabila dalam pengujian tidak terdapat kesalahan sistematik, maka nilai
pungut ulang yang diperoleh dalam uji ini tidak akan berbeda secara signifikan dari 100%.

Uji Relatif Terhadap Akurasi Metode Baku

Metode baku adalah metode standar yang diambil dari AOAC, USEPA, APHA atau sumber
serupa untuk memudahkan pelaksanaan suatu kegiatan guna mencapai tujuan yang
ditentukan. Pada prinsipnya, uji dilakukan dengan mengerjakan pengujian paralel atas contoh
uji yang sama menggunakan metode uji yang sedang dievaluasi dan metode uji lain yang
telah diakui sebagai metode baku. Apabila dalam pengujian tidak terdapat kesalahan
sistematik, maka tidak akan terdapat perbedaan data hasil uji yang signifikan dari kedua
pengujian tersebut.

Uji Terhadap Standard Reference Material (SRM)

SRM adalah bahan referensi yang bersertifikat yang sifatnya homogen danstabil yang
digunakan dalam proses pengukuran. Uji terhadap SRM untuk mengevaluasi akurasi suatu
metode uji dilakukan dengan menguji SRM dengan menggunakan metode uji yang sedang
dievaluasi. Harus diasumsikan bahwa nilai yang sebenarnya (true value) dari suatu bahan
yang akan diuji adalah seperti yang dinyatakan pada SRM tersebut. Bias (kekeliruan) hasil uji
dari metode uji yang dievaluasi terhadap true value menggambarkan seberapa tinggi akurasi
dari metode uji tersebut.
Presisi
Presisi didefinisikan sebagai kedekatan hasil yang diterima (baik sebagai nilai teoretis
maupun sebagai nilai rujukan yang diterima) dengan nilai yang diperoleh dari hasil
pengukuran. Suatu istilah umum untuk variasi antar pengulangan uji. Presisi juga merupakan
keadaan kedekatan antara hasil tes yang diperoleh di bawah kondisi yang ditetapkan.
Semakin dekat nilainilai hasil pengulangan pengukuran maka semakin tinggi presisi
pengukuran tersebut.
Batas Kuantitasi (LOQ / Limit of Quantitation).
Batas kuantitasi (LOQ) merupakan parameter yang diartikan sebagai konsentrasi terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Dapat
dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) dari kurva antara respon dan kemiringan.
Batas Deteksi (LOD / Limit of Detection)
Batas deteksi dinyatakan dengan satuan konsentrasi suatu zat yang secara statistik dapat
dibedakan dari blanko analitiknya. IUPAC (International Union Pure and Applied Chemistry)
pada tahun 1975 menetapkan definisi batas deteksi sebagai konsentrasi (CL) yang diturunkan
dari pengukuran sinyal terkecil (XL) yang masih dapat dideteksi dengan ketentuan yang
masuk akal bagi suatu prosedur analisis tertentu. Menurut ACS (American Chemical
Society), batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari suatu analit yang dapat
dideteksi oleh prosedur analisis.
Linearitas
Liniearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon yang secara langsung atau
dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proposional terhadap konsentrasi analit
dalam sampel. Linieritas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi

yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit
dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian
linieritas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil
analisis terhadap konsentrasi analit. Di dalam prakteknya, biasanya digunakan satu seri
larutan yang berbeda konsentrasi antara 0-200% kadar analit dalam sampel. Jumlah sampel
yang dianalisis sekurang-kurangnya tujuh buah.
Range
Range adalah interval antara atas dan bawah konsentrasi (jumlah) dari analit dalam sampel
(termasuk konsentrasi ini) untuk yang telah menunjukkan bahwa prosedur analitis memiliki
tingkat yang cocok dari segi presisi, akurasi, dan linearitas.
Robustness
Robustness adalah ukuran kapasitas metode yang tetap menghasilkan akurasi dan presisi
yang baik untuk tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil. Dilakukan untuk mengetahui
perubahan reliabilitas metode uji dengan berjalannya waktu karena rentannya metode uji
terhadap adanya perubahan kondisi pengujian.

-Prosedur Validasi Metode Analisis :

Spesifisitas
Spesifiitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang
mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, atau senyawa asing lainnya dengan hasil
analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil jika ada merupakan
selisih dari hasil uji keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau
tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel
yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu
dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisis

kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis
tersebut merupakan ukuran spesifitas. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi,
spesifitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs).
Linearitas Dan Range
Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung
berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel
dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian linearitas adalah
melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap
konsentrasi analit. Dalam beberapa kasus, untuk memperoleh hubungan proporsional antara
hasil pengukuran dengan konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui transformasi
matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya. Dalam praktek, digunakan satu seri
larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50 150% kadar analit dalam sampel. Di dalam
pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 200%. Jumlah
sampel yang dianalisis sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko. Sebagai parameter
adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a + bX.
Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau 1 bergantung pada arah
garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan.
Presisi
Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi).
Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan
(reproducibility). Keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh
analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan
dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang
terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang
normal. Ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda.
Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan
peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analis dilakukan terhadap sampelsampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Ketertiruan dapat juga
dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan
analis yang berbeda. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku
relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel
tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium.

Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit
yang dianalisis. Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya
konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium
adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm)
RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang
sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%.
Batas Deteksi Dan Batas Kuantitasi
Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu
menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas
tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat.
Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko
beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan Batas deteksi dan kuantitasi
juga dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai
pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y = a + bx, sedangkan
simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual.
Robustness
Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil
dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Sebagai
contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur HPLC dapat
mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak (1%), pH fase gerak
( 0,2 unit), dan perubahan temperatur kolom ( 2 - 3 C). Perubahan lainnya dapat
dilakukan bila sesuai dengan laboratorium. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis
yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah. Faktor orisinal ini dapat
diidentifikasi sebagai A, B, dan C. Perubahan nilai faktor-faktor ini dapat diidentifikasi
dengan a, b, dan c. Lakukan analisis pada kondisi yang telah disebutkan pada pemeriksaan
ketangguhan.
Nilai Faktor
A atau a
B atau b
C atau c

Penetapan Eksperimental
#1
#2
#3
A
A
a
B
b
B
C
c
c

#4
a
b
C

Untuk menentukan efek perubahan A, banding rata-rata hasil (#1+ #2) / 2 dengan (#3 + #4) /
2, Untuk efek perubahan B, bandingkan (#1 + #3) / 2 dengan (#2 + #4) / 2 dan seterusnya.

5. Semua parameter yang telah disebutkan diatas harus dilakukan pada saat validasi metode
analisis. Hal ini kembali pada tujuan awal melakukan validasi metode yaitu untuk menjamin
bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran
analit yang akan dianalisis. Selain itu untuk melihat dan alat yang digunakan masih memadai
atau personil yang melakukan analisis sudah cukup terlatih (Priyambodo, 2007).

Daftar Pustaka

Gandjar, I. G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal
463-464.
Anonim, 2006, The United State Pharmacopeia, 29 th Ed., United State Pharmacopeia
Convention Inc., Rockville, pp. 3050-3053.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah
Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No. 3

CPMP, 1995,

NOTE FOR GUIDANCE ON VALIDATION OF ANALYTICAL

PROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY, European Medicines Agency, London.

Priyambodo, B., 2007, Manajemen Industri Farmasi, Global Pustaka Utama: Yogyakarta.