Tes Limulus amebocyte lysate (LAL)

A. Sejarah dan Latar Belakang

The Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis
kuantitatif endotoksin bakteri. Limulus amebocytelysate (LAL) test adalah metode alternatif
terhadap rabbit pyrogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam produk,
untuk menghindari penggunaan hewan / binatang dalam percobaan.
Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus). Penggunaan
LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri
gram negatif (E. coli dan Pseudomonas) pada Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi
intravaskular yang parah. Tahun 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa
penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein yang dapat
menggumpal dalam amubosit shingga agen antiaggregating harus ditambahkan untuk
menghambat agregasi. N-Ethylmaleimade adalah yang paling umum digunakan sebagai anti-
aggregant.
Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan karaterisasi protein
yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin
merupakan reaksi enzimatik.
Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran besar ditangkap, cek
kesehatannya, lalu darahnya diambil dengan menggunakan jarum suntik. Darah kepiting ini
lalu disentrifuga untuk memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya.
 􀂄Amoebocytelaludifreeze-dried dan diproses untuk digunakan. Harganya: One quart of LAL is
worth $15,000!
B. Metode
Ada empat metode LAL saat ini dilisensi oleh FDA. Metode analisis LAL yang dilakukan
mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri). Yang pertama,
disebut sebagai metode gel-clot didasarkan pada kenyataan bahwa LAL gumpalan di hadapan
endotoksin. Metode turbidimetrik kinetik adalah metode kuantitatif yang digunakan LAL
kekeruhan penampilan untuk menentukan konten endotoksin. Metodologi yang ketiga dan
keempat, disebut sebagai chromogenic assaysemploy, sebuah chromogenic substrat sintetis
yang, di hadapan LAL dan endotoksin, menghasilkan warna kuning yang berhubungan linier
terhadap konsentrasi endotoksin.

C. Keuntungan dan Kerugian

Deteksi endotoksemia dengan uji LAL pertama kali dilakukan oleh Fossard, dkk pada
tahun 1974. Mereka menyimpulkan bahwa uji LAL cepat dan dapat diandalkan, metode
sederhana untuk mendeteksi endotoksemia. Deteksi dini dan pengobatan infeksi yang kuat
dengan uji LAL digunakan untuk memantau efektivitas pengobatan.
DeMurphy dan Aneiros menggunakan uji LAL metode mikro untuk mendeteksi pirogen
di radiofarmasi, termasuk koloid belerang, pirofosfat, piridoxiliden glutamat, albumin serum
manusia, dan makroagregat albumin manusia. Mereka menyimpulkan bahwa tes ini terbukti
ekonomis, mudah, cepat, sensitif, dan dapat diandalkan. Uji dimasukkan ke dalam program
pengawasan mutu rutin tidak hanya untuk radiofarmasi tetapi juga untuk semua cairan
parenteral dan larutan yang digunakan dalam penyusunan kit dalam kedokteran nuklir.
Rhodes dan Croft mencantumkan enam alasan mengapa uji LAL lebih disukai daripada
uji kelinci untuk pengujian pirogen radiofarmasi dan kit reagen:
1. Lebih sensitif.
2. Lebih cepat.
3. Membutuhkan jumlah yang lebih kecil dari bahan uji.
4. Kedua kontrol positif dan negatif dapat dilakukan bersama dengan masing-masing tes.
5. Tidak menghasilkan radioaktivitas dalam kelinci sehingga lebih disukai dari sudut pandang
keamanan radiologis.
6. Lebih murah dan lebih mudah dalam penyimpanan.
Uji LAL untuk pirogen dalam sediaan parenteral pertama kali digunakan oleh Cooper et
al. Uji LAL ditemukan lebih sensitif dan lebih bijaksana daripada uji pirogen kelinci dalam
pengujian produk obat radioaktif.

Perbandingan Uji Kelinci dengan Uji LAL

Perbedaan Uji kelinci LAL test

Metode Model Pengujian in vivo yang Model Pengujian in vitro. Uji in vitro,
pengujian menggunakan hewan yang hidup bila tersedia, lebih digunakan
sebagai modelnya. daripada tes in vivo. Metode ini lebih
menguntungkan, karena tidak ada
kesalahan/kegagalan akibat variasi
biologis.
Prinsip Injeksi intravena ke tubuh kelinci di Koagulasi protein yang ada dalam
bawah kondisi tertentu dan reagensia LAL oleh endotoksin.
selanjutnya dipantau dan dicatat Pengujian tersebut dinyatakan positif
temperature kelinci tersebut dalam apabila terjadi pembentukan gel dan
jangka waktu tetentu. dinyatakan negatif bila tidak terjadi
pembentukan gel. Pembentukan gel
akan terjadi apabila kandungan
endotoksin dalam contoh sediaan
lebih besar daripada sensitivitas
reagen yang dinyatakan dalam
Endotoksin Unit per ml (EU/ml) atau
ng/ml.
Sensitivitas Sensitivitas kelinci dan manusia Tidak dapat digunakan untuk
terhadap substansi pirogenik memeriksa beberapa sediaan secara
relative sama. Kenaikan suhu kelinci langsung, seperti:
akibat substansi-pirogenik, sampai >> Sediaan yang tidak dapat
batas tertentu masih dapat diterima dinetralkan menjadi pH 6-7, 5;
oleh manusia, sehingga kenaikan misalnya potasium kanrenoate.
suhu kelinci tersebut dapat >> Sediaan yang mengandung zat-
distandardisasi terhadap substansi zat penghambat pembentukan gel
pirogenik yang dapat diterima misalnya konsentrasi Ca tinggi,
manusia. Sensitivitas sangat tetrasiklin, streptomisin, polimisin,
dipengaruhi oleh musim, kloramfenikol, penisilin semisintetik,
kegaduhan, kegelisahan,makanan sitrat, fosfat dan lain-lain
dan lain sebagainya.
Sensitivitas Respon pirogenik pada kelinci LAL mendeteksi endotoksin lebih
bergantung dosis. Semakin besar sensitif dibandingkan kelinci. Pada
jumlah pirogen yang disuntikkan per umumnya, terlihat bahwa test LAL
kg BB, maka semakin besar sensitive terhadap satuan pictogram
kenaikan suhu pada kelinci. dari endotoksin, dan LAL test ini 5-
Sensitivitas dari bioassay kelinci 50 kali lebih sensitive dibandingkan
 untuk endotoksin muncul jatuh dengan uji kelinci terhadap
dalam kisaran 1 sampai 10 ng/kg keberadaan endotoksin. Sensitivitas
LAL mencapai 0,01 - 0,04 ng/ml
atau lebih kecil.
Objek yang Mampu mendeteksi semua pirogen LAL hanya mendeteksi endotoksin
dapat termasuk endotoksin dan tidak mampu mendeteksi
dideteksi pirogen eksogen yang lain seperti
virus, fungi, bakteri dan lain-lain.
Selain itu, LAL hanya dapat
diandalkan untuk mendeteksi pirogen
yang berasal dari bakteri gram-
negatif.
Waktu Membutuhkan waktu lebih lama Waktu yang dipergunakan untuk
dalam perlakuan awal penyiapan melakukan pengujian lebih singkat,
hewan dan waktu yang dihabiskan baik pada waktu pelaksanaan
dalam penyesuaian hewan untuk maupun waktu persiapannya. Hasil
beradaptasi dengan kondisi fasilitas tersedia dalam waktu 90 menit
pengujian pirogen dan tes itu setelah awal prosedur uji
sendiri.
Fasilitas Memerlukan pemeliharaan dan Ruangan yang digunakan relatif lebih
yang perawatan hewan dan laboratorium kecil dan personil yang dibutuhkan
dibutuhkan yang lebih intensif. Karena hewan uji relatif sedikit.
yang digunakan, yaitu kelinci,
sangat sensitif dan rentan terhadap
lingkungannya. Hewan harus
dipelihara dalam ruangan dengan
temperatur tidak jauh berbeda
dengan tempat percobaan.
Pemeliharaan hewan harus
dilakukan dengan sebaik mungkin
untuk menghindari infeksi penyakit
yang dapat mengganggu percobaan
atau mengacaukan interpretasi
hasil. Berat badan kelinci harus
dijaga jangan sampai mengalami
penurunan yang berarti dalam 1
minggu menjelang digunakan.
Variabilitas Variabilitas sistem biologis yang Kontrol teknik, penanganan, dan
besar, misalnya, tidak ada dua faktor lingkungan eksternal jauh lebih
kelinci akan memiliki suhu tubuh mudah diatur dengan uji LAL. Hal ini,
yang persis sama atau identik meminimalkan peluang kesalahan
merespon terhadap sampel dan variasi dalam pengujian hasil.
pirogenik yang sama. Respon setiap
kelinci terhadap substansi yang
sama belum tentu sama, sehingga
terdapat variasi kenaikan suhu pada
tiap kelinci.
Biaya Memerlukan biaya yang mahal yang Memerlukan biaya lebih sedikit
banyak digunakan dalam perlakuan
awal penyiapan hewan. Kelinci
harus diberi makan dan minum
dengan benar, kandang dibersihkan
untuk mencegah penyakit, dan
waktu yang dihabiskan dalam
penyesuaian hewan untuk
beradaptasi dengan kondisi fasilitas
 pengujian pirogen dan tes itu
sendiri.

Sensitivitas kelinci terhadap Sensitivitas LAL dengan endotoksin

endotoksin bervariasi dengan hari bervariasi pada berbagai sumber
(sirkadian) dan tahun (cirannual) mikroba.
Gangguan Gangguan dari Uji Pirogen Kelinci gangguan interaksi lisis-endotoksin
pada Banyak produk parenteral yang yang disebabkan oleh berbagai obat
proses diberikan tidak dapat diuji untuk dan zat lainnya.
pengujian pirogen dengan uji kelinci karena
gangguan yang mereka buat dalam
respon kelinci terhadap pirogen jika
mereka hadir dalam produk
tersebut. Setiap produk memiliki
efek samping menurunkan suhu
badan, seperti prostaglandin dan
agen kemoterapi kanker, akan
mengganggu respon kelinci.
Beberapa produk secara inheren
 toksik untuk kelinci dan harus
diencerkan dengan konsentrasi jauh
di bawah dosis farmakologis efektif
obat.
Bahan Jumlah bahan uji yang dibutuhkan Jumlah bahan uji yang dibutuhkan
yang lebih banyak. lebih sedikit
digunakan

· Mekanisme Reaksi
Elusidasi dari reaksi endotoksin-LAL telah dihasilkan terutama dari karya oleh Liu et al.,
Takagi et al., dan Mosesson et al. Menggabungkan hasil dari peneliti ini menghasilkan reaksi yang
diusulkan sebagai berikut:
1. Endotoksin atau disusun sesuai lipid A dari derivate endotoksin mengaktifkan proenzyme
dari LAL yang memiliki berat molekul 150.000
2. Aktivasi juga tergantung adanya kation logam divalen seperti kalsium, mangan, atau
magnesium. Telah terbukti bahwa sensitivitas LAL assay untuk deteksi endotoksin dapat
meningkat 10 sampai 30 kali dengan menggunakan reagen LAL yang mengandung 50 mM
magnesium.
 3. Aktivasi proenzyme, terkait dengan kelas protease serin seperti enzim trombin, tripsin, dan
faktor Xa, kemudian bereaksi dengan fraksi protein berat molekul rendah (MW_ 19.000-
25.000) yang terdapat juga dalam substansi LAL.
4. Fraksi berat molekul lebih rendah, yang disebut coagulogen, dipotong oleh proenzyme ke
dalam subunit larut dan tak larut. Subunit tak larut muncul sebagai gumpalan padat,
endapan, atau larutan keruh, tergantung pada jumlah coagulogen tak larut oleh produk yang
dibentuk.

Ringkasan Standar FDA Mengatur Pembuatan Reagen Limulus Amebocyte Lysate

· Penggunaan Endotoksin Standar AS untuk menentukan sensitivitas LAL.
· Penggunaan LAL Referensi AS untuk menetapkan potensi LAL.
· Perhitungan potensi tiap sejumlah LAL dan LAL Referensi AS menggunakan Endotoksin
Standar AS.
a. Uji minimum 20 dari maksimum 28 botol per setiap bejana pengeringan.
b. 99% batas atas fiducial dari standar deviasi rasio log referensi dan uji lysates untuk 20 vial tidak
lebih besar dari 0,73.
· Persyaratan umum.
a. Menangani kepiting tapal kuda sedemikian rupa untuk memungkinkan mereka dikembalikan
hidup pada lingkungan alam mereka setelah single collection of blood.
b. Lakukan uji sterilitas massal dan pada setiap pengisian.
c. Jalankan uji kontrol negatif dari lysate.
d. Uji untuk kelembaban residual.
· Berbagai pelabelan.
· Jumlah sampel yang tepat (tidak kurang dari 28 botol) dan dokumentasi pembuatan pada setiap
pengisian, tanggal pengujian, dan hasil dari semua uji harus disampaikan kepada Director, Bureau
of Biologics, FDA.
Oleh karena itu, reaksi koagulasi membutuhkan tiga faktor selain endotoksin. Ketiga faktor itu-
enzim pembekuan darah, clottable protein (coagulogen), dan beberapa kation divalen-ditemukan
pada reagen LAL. Skema reperesentasi mekanisme reaksi LAL ditemukan pada Gambar..3.

· Prosedur Uji LAL

Cooper adalah orang pertama yang menggambarkan metode dan bahan yang dibutuhkan
untuk melakukan uji LAL untuk pirogen secara benar. Sementara itu, meskipun uji LAL merupakan
prosedur yang relatif sederhana, terutama bila dibandingkan dengan uji kelinci menurut USP, namn
kondisi spesifik tertentu harus dipenuhi. Hal yang haus diperhatikan antara lain. :
 Gambar. 3 Skema Representasi dari mekanisme reaksi LAL.

1. Semua bahan yang akan berkontak dengan reagen LAL atau sampel uji harus dibersihkan dan
didepirogenasi secara menyeluruh.
2. Suhu reaksi tidak dapat diluar rentang 36-380C.
3. Campuran reaksi harus berada dalam kisaran pH 5-7.
4. Waktu reaksi harus tidak lebih dari 1 jam.
5. Setiap pengujian harus disertai dengan kontrol positif dan negatif

Prosedur dasar pengujian LAL adalah kombinasi 0,1 ml sampel uji dengan 0,1 ml reagen
LAL. Setelah 1 jam inkubasi pada suhu 370C, campuran dianalisis untuk melihat adanya sebuah
gumpalan gel. Uji LAL positif, menunjukkan adanya endotoksin, jika gumpalan gel menjaga
integritasnya setelah inversi lambat dari tabung reaksi berisi campuran (lihat Gambar.4).
Petunjuk lengkap untuk melakukan uji LAL ditemukan pada kit uji LAL dari produsen
komersial. USP (edisi 22) juga berisi petunjuk untuk menggunakan uji LAL untuk memperkirakan
konsentrasi endotoksin bakteri dalam sampel bahan. Instruksi-instruksi ini diringkas dengan
komentar di bawah ini:

Gambar 4. Sebuah tes gel LAL bekuan positif ditandai oleh pembentukan gel padat yang tetap
utuh di dasar tabung pada inversi. (Courtesy of BioWhittaker, Inc, Walkersville, Maryland).

►Pendahuluan
1. Teknik aseptik yang ketat harus digunakan untuk menghindari kontaminasi mikroba selama
melakukan tes.
2. Semua wadah dan peralatan yang digunakan harus bebas pirogen. Pemanasan pada 250 0C
atau lebih untuk minimal 60 menit untuk mendepirogenasi barang tersebut
3. Semua barang pecah belah harus dicuci dengan deterjen sebelum depirogenasi panas kering.
Jika deterjen tidak sepenuhnya dicuci, akan mengganggu dan menyebabkan reaksi hasil negatif
yang salah
4. Mematuhi semua tindakan pencegahan dalam merekonstitusi dan menyimpan reagen uji.
Jangan simpan endotoksin encer digunakan untuk menentukan sensitivitas LAL karena hilangnya
aktivitas oleh adsorpsi pada permukaan kaca. Masa simpan normal untuk reagen LAL adalah 4
minggu pada suhu dingin setelah rekonstitusi.

· Prosedur Tes Limulus Amoebisit Lysate (LAL Test)

Copper yang pertama kali memperkenalkan metode dan bahan apa saja yang dibutuhkan
dalam tes LAL untuk pirogen.
Kondisi khusus yang butuhkan dalam proses pelaksanaan tes LAL:
· Semua bahan yang kontas langsung dengan reagen LAL seluruhnya harus bersih dan bebas
dari pirogen. Pemanasan dilakukan pada suhu 2500C atau lebih sekurang –kurangnya selama 1
jam.
· Semua peralatan kaca harus dibersihkan dahulu dengan detergen sebelum dilakukan
depirogenasi panas kering.
· Suhu yang dibutuhkan saat reaksi harus dalam interval 36 0-380C
· pH dalam reaksi pencampuran harus berada dalam interval pH 5-7
· Setiap reaksi yang dilakukan harus disertai blanko positif dan negatifnya

Prosedur pelaksanaan:
1. Siapkan 0,1 ml sampel tes dan 0,1 ml reagen LAL
2. Campur keduanya kemudian di inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C
3. Setelah di inkubasi, campuran tersebut kemudian dianalisis untuk mengetahui ada atau tidaknya
gumpalan gel
4. Tes LAL dikatakan positif berarti ada indikasi adanya endotoksin jika gumpalan gel tetap
bertahan tidak jatuh saat tabung dibalikkan.

► Standard Penentuan Endotoksin

Referensi Standard Endotoksin (RSE) yang pertama kali adalah Lot-EC2 yang didefinisikan
1 Endotoxin Unit (EU) dalam 0,2 ng standard dan dalam 1 vial terdapat 10.000 EU.
Standard lain yang umumnya digunakan adalah CSE (Control Standard Endotoxin) yang
harus di standardisasi kembali terhadap RSE. Berikut standardisasi yang dilakukan:
· Minimal 4 vial yang mengandung gumpalan di uji dengan menentukan titik akhir dengan LAL.
· Konversi titik akhir CSE yang berupang/ml kedalam RSE yang memiliki satuan endotoxin unit
per milliliter. Jadi, jika titik akhir LAL pada CSE 0,018 ng/ml dan titik akhir LAL pada RSE 0,3 EU/ml
maka,
o RSE 0,3 EU/ml = 16,6 EU/ng CSE,
o CSE 0,018 ng/ml
Jadi, 0,018 ng CSE setaradengan 0,3 EU RSE.

►Prosedur Manual Tes LAL

Lakukan pengulangan sampling minimal 4 kali pada sampel yang akan digunakan. pH yang
akan digunakan dalam reaksi pencampuran berada dalam range 6-7,5 kecuali dinyatakan lain
secara spesifik dalam monografi. Perubahan pH dapat dikendalikan dengan penambahan buffer
tertentu atau campuran endotoksin bebas 0,1 NaCl dan 0,1 HCl.
Tes pipa, menggunakan 10 pipa dengan ukuran 7,5 mm dimana semuanya dimasukkan
aliquot biasanya sebanyak 0,1 ml. Kemudian, reagen LAL di siapkan sebanyak volume aliquot yang
digunakan sebelumnya. Dalam tes pipa lainnya, jumlah volume reagen LAL dan endotoksin
starndard dijumlahkan.
Kontrol positif adalah reagen LAL dengan sampel yang mengandung konsentrasi endotoksin
yang telah diketahui. Sedangkan kontrol negatif adalah reagen LAL ditambah jumlah volume
sampel steril yang sama yaitu jumlah pirogen dan pelarut bebas.
 Saat jumlah volume yang sama tersebut dicampurkan, tes pipa dimulai dengan diputar
perlahan-lahan. Kemudian pipa tersebut ditempatkan pada temperatur yang konstan pada water
bath menggunakan kontrol suhu 370C ± 10C. Waktu inkubasi idealnya 60 menit. Pada saat inkubasi,
pipa jangan sampai terjadi gangguan seperti digerakkan dan sebagainya khawatir akan ada
gumpalan yang akan lepas secara irreversibel sehingga mengurangi hasil akhirnya. Setelah
inkubasi, keluarkan pipa secara hati-hati.
Analisis hasil inkubasi dengan menggunakan microskop. Satu kaca objek dapat
mengidentifikasi 12 sampel menggunakan volume mikroliter 0,1 mikroliter. Tambahkan toluidin biru
0,1% dalam etanol ke dalam kaca tersebut. Positif uji LAL ditandai dengan adanya drople-droplet
biru sedangkan hasil negatifnya berupa warna biru yang homogen tanpa adanya droplet.

► Sensitivitas dari LAL

Sensitivitas dari LAL didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari endotoksin yang murni
yang memproduksi gel keras yang akan tetap utuh ketika ditelungkupkan secara hati-hati selama
1 jam inkubasi pada suhu 370 C. Pada umumnya, terlihat bahwa uji LAL sensitif terhadap satuan
pictogram dari endotoksin, dan LAL test ini 5-50 kali lebih sensitif dibandingkan dengan uji kelinci
terhadap keberadaan endotoksin, bergantung pada jenis studi perbandingan yang dilakukan.
Penelitian terdahulu yang dilakukan oleh cooper et al menunjukkan bahwa uji LAL
setidaknya lima kali lebih sensitif terhadap endotoksin murni dibandingkan dengan uji kelinci. Hal
ini kemudian ditegaskan kembali oleh Elin dan Wolff. Perbaikan dalam produksi LAL dan metode
formulasi akan meningkatkan sensitivitas dari LAL 10 sampai 50 kali lebih besar dibandingkan
dengan uji kelinci.
Ronneberger menemukan bahwa LAL test memberikan hasil yang sama atau 10 kali lebih
sensitif dibandingkan dengan uji kelinci menggunakan lipopolisakarida dari bakteri gram negatif
yang berbeda (table 2.5). Pada lebih dari 300 sampel obat, uji LAL dan uji kelinci memberikan hasil
yang sama, meskipun injeksi dalam volume besar menghasilkan sensitivitas yang rendah dalam
uji kelinci.

Tabel 7. Spesifisitas dan sensitivitas LAL untuk deteksi Lipopolysakarida

 Marcus and Nelson mengatakan bahwa uji pirogen pada kelinci akan mendeteksi 1 sampai
10 ng endotoksin enterobakterial, sedangkan uji LAL akan mendeteksi 0,01 sampai 0,1 ng
endotoksin per milliliter larutan. Kemampuan dari LAL dalam mendeteksi endotoksin E.coli dalam
air terdestilasi yang bebas pirogen ditemukan mencapai 100 kali lebih sensitif dibandingkan dengan
uji kelinci.
Sensitivitas dari LAL terhadap endotoksin begantung pada pembawa dimana terkandung
endotosin tersebut. Misalnya LAL hanya dapat mendeteksi 5-10 µg/ml endotoksin dalam plasma,
sedangkan 0,05 µg/ml endotoksin dideteksi dalam cairan serebrospinal. Banyak produk obat
menghalangi uji LAL dan sangat menghambat kepekaannya.

►Spesifikasi Tes
Sensitivitas merupakan kemampuan uji untuk memberikan reaksi positif terhadap kehadiran
dari material yang diuji, sedangkan spesifisitas merupakan kemampuan dari tes untuk memberikan
reaksi positif hanya pada material yang diuji. Sensitivitas dari LAL terhadap endotoksin tidak perlu
dipermasalahkan. Namun, spesifisitasnya dalam bereaksi hanya pada endotoksin tertentu
merupakan karakteristik penting yang diperdebatkan.
Pada 1973, Elin and Wolff pertama kali melaporkan kekurangan yang mungkin dari
spesifisitas pada uji LAL untuk endotoksin bakteri. Pemberian immunoglobulin intravena telah
 ditemukan untuk menghasilkan hasil positif palsu pada uji LAL. Peningkatkan jumlah imunoglobulin
yang diberikan akan meningkatkan level material LAL reaktif dalam plasma.
amibocyte lysate mengandung zat yang disebut factor sensitive (1–3) β-D-glucan. Faktor ini dapat
mengaktivasi LAL untuk memproduksi hasil positif palsu terhadap keberadaan endotoksin.
Menariknya, jumlah kecil dari β-glucan (1–1000 ng/ml plasma) akan memicu gelasi, sementara
jumlah yang lebih besar β-glucan (1 mg/ml plasma) tidak dapat melakukannya.
Pearson and Weary menyebutkan bahwa reaksi positif palsu itu disebabkan oleh zat non
endotoksin. Mereka menyimpulkan bahwa zat tersebut tidak memerlukan perhatian dari produsen
obat parenteral dikarenakan:
1. Banyak zat (termasuk zat sintetik) tidak akan ditemukan dalam produk parenteral.
2. Zat tersebut mungkin saja ada, namun konsentrasinya tidak cukup untuk memproduksi
gelation in lysate atau demam pada kelinci.
3. Hasil belum dikonfirmasi oleh peneliti lain.
4. Hasil negatif dari uji LAL menunjukan dengan tegas ketiadaan endotoksin. Mengenai
kesalahan negatif palsu, dapat dieliminasi dengan proses validasi.

· Keuntungan Dibandingkan Dengan USP Uji kelinci

Pendukung dari uji LAL menyatakan bahwa uji tersebut memberikan setidaknya tujuh
keuntungan dibandingkan dengan penggunaan uji kelinci untuk mendeteksi pirogen dalam produk
injeksi parenteral dan peralatan medis:
1. Sensitivitas yang lebih besar
2. Reliabilitas yang lebih besar
3. Spesifisitas yang lebih baik
4. Variasi yang lebih sedikit
5. Aplikasi penggunaan yang lebih luas
6. Digunakan sebagai alat pemecahan masalah
7. Biaya lebih sedikit.
Sebagian besar keuntungan adalah akibat langsung dari kesederhanaan yang luar biasa
dari uji LAL. Uji in vitro membutuhkan jumlah item minimal untuk menyelesaikan uji, LAL
menawarkan kecepatan dan kehandalan yang tak tertandingi oleh sistem in vivo.
Kontrol teknik, penanganan, dan faktor lingkungan eksternal jauh lebih mudah diatur dengan
uji LAL. Hal ini meminimalkan peluang kesalahan dan variasi dalam pengujian hasil. Kemudahan
dan kemampuan beradaptasi dari uji LAL memungkinkan untuk digunakan dalam berbagai situasi
dimana penerapan uji kelinci akan tidak dapat atau tidak mungkin dipraktekkan.
Uji LAL telah menjadi pengganti yang diterima untuk uji kelinci dalam mengontrol pirogen
dalam proses-fraksi plasma. Empat keuntungan yang diberikan jika mengganti uji LAL dengan uji
kelinci adalah sebagai berikut:
1. uji in vitro, bila tersedia, lebih digunakan daripada uji pada hewan.
2. Hasil tersedia dalam waktu 90 menit setelah awal prosedur uji.
 3. Uji yang dapat dilakukan dengan LAL bila uji menggunakan kelinci tidak masuk akal karena
faktor waktu.
4. Uji LAL sederhana untuj dilakukan dan tidak mahal.
Fumarola dan Jirillio menyatakan bahwa menurut beberapa literatur yang berhubungan
dengan uji LAL serta berdasarkan pengalaman, uji dapat diterima, spesifik, cepat, dan metode yang
sensitif untuk uji endotoksin obat parenteral dan produk biologi dan untuk pengujian dalam larutan
parenteral.
Peneliti di Laboratorium Travenol telah menerbitkan banyak artikel penyediaan data untuk
mendukung keunggulan uji LAL atas uji kelinci untuk pengujian pirogen dari LVPs. Argumen
mereka dirangkum oleh Mascoli dan weary:
1. Pirogen penting dalam produk LVP dan perangkatnya merupakan endotoksin yang terdapat
di alam.
2. Beberapa endotoksin pirogen yang terdeteksi oleh LAL, terdeteksi juga dengan uji kelinci.
3. Dalam beberapa kasus, hasil uji kelinci hanya gagal pada awalnya untuk mendeteksi
pirogen yang dikonfirmasi kemudian oleh uji kelinci, tapi selalu dikonfirmasi terlebih dahulu
dengan uji LAL.
Keuntungan uji LAL yang dikemukakan oleh beberapa perusahaan produsen produk
parenteral antara lain yaitu:
a. sensitivitas yang lebih besar
b. variasi yang lebih kecil
 c. hasil yang diperoleh kuantitatif
d. waktu yang diperlukan lebih sedikit
e. lebih murah
f. pelaksanaan tes lebih mudah

· Keterbatasan Dari Uji LAL

Tidak diragukan lagi, uji LAL memenuhi kebutuhan akan suatu metode yang berguna,
sensitif, akurat, dan murah untuk mendeteksi endotoksin bakteri. Namun, bukan berarti tanpa
keterbatasan atau masalah.
Keterbatasan terbesar uji LAL adalah masalah gangguan interaksi lysate-endotoksin yang
disebabkan oleh berbagai obat dan zat lainnya. Dari 10 perwakilan kontrol kualitas dari industri
parenteral yang disurvei, 7 mengidentifikasi hambatan dari interaksi lysate-endotoksin sebagai
faktor pembatas nomor satu dari penerapan uji LAL. Seperti yang telah dibahas sebelumnya, reaksi
gelasi LAL ditengahi oleh enzim pembekuan yang thermolabil, sensitif terhadap pH, dan secara
kimia terkait dengan tripsin. Inhibisi disebabkan oleh bahan yang diketahui dapat mendenaturasi
protein atau menghambat kerja enzim. Daftar beberapa obat dan bahan-bahan yang dikenal dapat
mengubah atau menghambat interaksi lysate-endotoksin diberikan dalam Tabel 8. Hambatan oleh
banyak komponen obat dapat diatasi dengan pengenceran atau penyesuaian pH. Tentu saja,
pengenceran mengurangi konsentrasi endotoksin dan tempat yang dibutuhkan lebih besar untuk
mendeteksi jumlah endotoksin yang diencerkan.
Tabel 8 contoh dari SPVs yang dilaporkan dapat menghambat tes LAL

Pengujian inhibisi atau aktivasi pada dasarnya melibatkan penggunaan kontrol positif. Hasil
akhir dari deteksi pada sampel produk tidak boleh berbeda dari titik akhir pada standar seri. Dengan
kata lain, jika jumlah terendah endotoksin yang terdeteksi adalah 0,025 ng / ml, jumlah ini juga
harus terdeteksi oleh banyak sama reagen LAL dalam sampel produk. Jika ditemukan tejadi
inhibisi, dilakukan pengenceran terhadap sampel produk sampai tidak ada lagi modifikasi pada
reaksi gelasi.
· Hambatan
Menurut Cooper, 30% dari produk obat tidak menghambat uji LAL. Mayoritas produk yang
menghambat uji, 97% dari masalah dapat diatasi karena hambatan bergantung pada konsentrasi.

Reaksi LAL-Endotoksin
Uji inhibisi LAL dianggap signifikan jika kontrol positif bervariasi lebih dari dua kali lipat dari
pengenceran standar dalam air.
Penyebab utama produk obat menghambat uji LAL adalah dengan:
1. pH yang tidak optimal
2. Agregasi atau adsorpsi endotoksin control
3. Konsentrasi kation yang tidak sesuai
4. Modifikasi enzim atau protein
5. Aktivasi LAL non spesifik
Keterbatasan uji LAL adalah sebagai berikut:
1. LAL hanya dapat diandalkan untuk mendeteksi pirogen yang berasal dari bakteri gram negatif.
2. Sebagai uji in vitro, uji LAL tidak dapat mengukur potensi demam yang memproduksi endotoksin
yang terdapat dalam sampel.
3. Sensitivitas LAL dengan endotoksin bervariasi pada berbagai sumber mikroba.
4. Sulit untuk membandingkan sensitivitas uji LAL dan uji kelinci karena uji kelinci bergantung pada
dosis, sedangkan uji LAL adalah tergantung konsentrasi.
5. Pembentukan gel sulit untuk menafsirkan dan dapat rusak dengan adanya sedikit getaran.
6. Uji LAL terlalu sensitif yang dapat mendeteksi endotoksin pada tingkat rendah yang dibutuhkan
untuk memproduksi demam pada mamalia.
7. Potensial terganggu oleh β-glucans.
8. Studi yang lebih ekstensif diperlukan untuk memvalidasi uji LAL sebagai uji pirogen pada produk
akhir

· Variabilitas Uji
Ada beberapa sumber variabilitas yang dapat mempengaruhi keakuratan dan keandalan uji
LAL. Hal ini menjawab kenapa validasi sangat penting dan mengapa FDA membuat pedoman
validasi untuk uji LAL. Pearson dan Mc. Cullough telah menulis ulasan mengenai masalah ini.
1. Variabilitas reagen
Ada perbedaan yang signifikan dalam formulasi reagen LAL dari tiap produsen. Walaupun semua
reagen LAL telah dibakukan berdasarkan RSE USP, proses pembuatan yang baik dan perbedaan
formulasi terlihat dalam kondisi endotoksin. perbedaan utama dalam persiapan pereaksi meliputi
penambahan bahan-bahan sebagai berikut: kation divalen, albumin, buffer, dan bahan aktif
permukaan.
2. Variabilitas metode
 Reagen LAL dirancang khusus untuk menghasilkan aktivitas yang optimal dalam setiap uji LAL.
Jadi, lysate–drug product compatibility dapat berubah bila beralih dari satu metode uji ke metode
uji yang lain dengan menggunakan produsen lysate yang sama.
3. Variabilitas produk
Telah diketahui bahwa banyak produk parenteral akan terganggu reaksi lisis-endotoksin, meskipun
sebagian besar gangguan tersebut dapat diatasi dengan pengenceran.
4. Variabilitas laboratorium
Tipe dari peralatan gelas dan lastik yang digunakan, prosedur kalibrasi peralatan, prosedur
kalibrasi ulang, kemurnian air yang digunakan, prosedur pengenceran, dan prosedur laboratorium
yang berbeda akan menghasilkan variabilitas uji LAL. Seperti dijelaskan sebelumnya, perbedaan
dalam penanganan dan penyimpanan produk parenteral sebelum analisis uji LAL nyata dapat
mempengaruhi hasil uji.
Sebagai pengulangan, untuk mengendalikan semua sumber-sumber variabilitas, FDA
menulis panduan pada validasi dari uji LAL. Pedoman mengatakan, "inhibition/uji perangkat
tambahan harus diulang pada satu unit produk yang jika pabrik lysate berubah. Ketika lysate
banyak berubah, kontrol positif dua lambda digunakan untuk kembali memverifikasi validitas uji
LAL untuk produk.

Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan adanya endotoksin

􀂄Metode kinetik turbidimetri: menggunakan kecepatan pembentukan gel untuk menentukan
kandungan endotoksin
􀂄Metode Kromogenik: menggunakan substrat kromogenik sintetik, dengan adanya LAL dan
endotoksin, menghasilkan warna kuning dan secara linier ekuivalen dengan konsentrasi
endotoksin yang ada

Tes LAL meupakan tes yang sangat sederhana. Dalam

sistem tes-mikro volume 10-µl (tetes) dari uji
bahanyang dicampur dengan lisat dalam petri dish yang steril dan diinkubasi pada suhu 37 ° C
selama 30 menit.
Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya gel,
sedangkan dalam reaksi negatif campuran
tetap cair. Cara lain dalam membedakan yaitu dengan memiringkan petri dish atau dengan
menekan dengan lembut
sisi piring; gel positif tetap tak tergoyahkan
sedangkan reaksi negatif menunjukkan adanya aliran atau getaran pada petri dish.
reaksi visualisasi ditingkatkan ketika
jumlah kecil (<5 µl) metilen biru 0,1% adalah
tambah (Hussaini dan Sawtell, 1986) tapi masalah
subjektivitas dalam menafsirkan titik akhir kurang
dari gelasi lengkap tidak dipisahkan dengan
metode ini

Metodekromogenik ada2 :
􀂄End point chromogenic
􀂄Kinetic chromogenic
􀂄Pemilihan metode tergantung pada penggunaan, volume uji, dan
tipe produk

Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari kepiting landam kuda
terhadap invasi bakteri gram negatif.
•Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting landam kuda
terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang
berinteraksi menyebabkan koagulasi
•Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim dalam lisatamubosit Limulus. Kecepatan
awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin

􀂄Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu
protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisatamubosit Limulus menghasilkan
koagulin.
 􀂄Sekalite rhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan membentuk suatu
gumpalan/bekuan seperti gel

Penetapanbatasendotoksin
􀂄1983 : FDA
menentukanbatasendotoksinberdasarkandosismaksimumsediaanobatuntukmanusiaataukelinci
􀂄danpenyesuaianbatasendotoksinuntuksemuaobat(kecualiintratekal) dari2,5 EU kg-1sampai5,0
EU kg-1
􀂄EU = Endotoxin Unit

Batas deteksiuntukbeberapaprodukdiperolehdarimonografiUSP atauEP.

Kalautidakdinyatakandalamfarmakope,
batasendotoksinharusdihitungdaridosismaksimummanusia