NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”

NIM : F1C117021

Enzim restriksi
Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang memotong molekul DNA.[1]
Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa.[1] Setiap enzim
mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang
basa.[2]

Sejarah
Pada akhir 1960-an, ilmuwan Stewart Linn dan Werner Arber mengisolasi dua contoh enzim
yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteriofag yang menyerang E. coli.[3] Salah
satu enzim bekerja memetilasi DNA, sedangkan enzim yang satunya bekerja memotong DNA
yang tidak termetilasi pada beberapa lokasi di sepanjang molekul DNA.[3] Enzim yang
pertama disebut metilase (methylase), sedangkan enzim yang satunya disebut nuklease
restriksi (restriction nuclease).[3] Kemudian pada tahun 1968, H.O. Smith, K.W. Wilcox, dan
T.J. Kelley, yang bekerja di Johns Hopkins University, mengisolasi dan mengkarakterisasi
enzim nuklease restriksi pertama.[3] Enzim ini berasal dari bakteri Haemophilus influenzae,
dan diberi nama HindII.[3] Enzim ini selalu memotong molekul DNA pada sekuen spesifik
dengan panjang situs pengenalan enam pasang basa.[3]
Sekuens pengenal enzim restriksi
Sekuen pengenalan atau sering disebut juga situs Tabel 1 Contoh enzim restriksi
pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi beserta sekuen pengenalannya
tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan Enzim Sekuen Pengenalan
GGATCC
pemotongan pada sekuen tersebut.[4] Panjang sekuen BamHI
CCTAGG
pengenalan enzim restriksi berbeda-beda, seperti enzim GCGGCCGC
EcoRI, SacI, dan SstI mempunyai sekuen pengenalan NotI
CGCCGGCG
sepanjang 6 pasang basa, sedangkan NotI 8 pasang GATC
Sau3AI
basa, dan Sau3AI hanya 4 pasang basa.[4] Kebanyakan CTAG
dari enzim restriksi bersifat palindromik (palindromic) SacI GAGCTC

yang berarti sekuen pengenalan sama jika dibaca dari CTCGAG

GAGCTC
5’3’ baik utas atas maupun utas bawah.[4] Contohnya Sst I
CTCGAG
adalah HindIII dengan situs pengenalan 5’-AAGCTT- GANTC 3’
HinfI
(utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah).[4] CTNAG
Enzim restriksi yang berbeda, dapat mempunyai situs PuGATCPy
XhoII
pengenalan yang sama, contohnya: SacI dan SstI.[5] PyCTAGPu
Ezim yang mempunyai situs pengenalan yang sama disebut dengan istilah isoschizomers.[5]
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

Dalam beberapa kasus, isoschizomers juga memotong DNA pada tempat yang sama, tetapi
beberapa tidak demikian.[5]
Situs pengenalan pada enzim restriksi dapat pasti atau ambigu.[5] Seperti contohnya pada
BamHI, enzim ini sudah pasti memotong pada sekuen GGATCC.[5] Sementara itu, situs
pengenalan HinfI adalah GANTC.[5] N dalam situs pemotongan HinfI berarti dapat diganti
oleh basa apa saja, inilah yang dimaksud dengan situs ambigu [5]. Contoh lainnya situs ambigu
adalah XhoII.[5] Enzim ini mempunyai situs pemotongan PuGATCPy.[5] Pu merupakan
singkatan dari purin (basa A atau G), sedangkan Py merupakan singkatan dari pirimidin
(pyrimidine) (basa T atau C).[5] Jadi XhoII dapat mengenali dan memotong sekuen AGATCT,
AGATCC, GGATCT dan GGATCC.[5]
Situs pengenalan satu enzim, dapat mengandung situs pengenalan enzim lainnya [5] Situs
pengenalan BamHI mengandung situs pengenalan Sau3AI.[5] Oleh karena itu, semua sekuen
pemotongan BamHI akan dipotong oleh Sau3AI, tetapi tidak sebaliknya.[5]
Perkiraan Pemotongan
Panjang dari sekuen pengenalan memengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA
dalam ukuran tertentu.[6] Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini
diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida.[6] Perhitungan tersebut diperoleh dengan
mengasumsikan setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu
sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa).[6] Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai
panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4) 6 = 1/4096.[6] Perhitungan ini hanya
sebagai perkiraan, pada kenyataannya belum tentu demikian. [6] Beberapa sekuen bisa jadi
lebih sering atau lebih jarang ditemui dalam suatu organisme.[6] Seperti pada mamalia, sekuen
CG sangat jarang ditemui sehingga enzim HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG
akan lebih jarang memotong pada DNA mamalia.[6]
Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan banyak
potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan
dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit.[6] Baik enzim yang mempunyai sekuen
pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa
genetika.[6]
Beberapa enzim sering yang digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga berdasarkan
perkiraan pemotongan:[6]
6-cutters
Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan yang spesifik pada
6 nukleotida.[6] Ezim ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

ini lumayan sering memotong satu atau dua situs pada plasmid, tetapi jarang memotong
bagian penting seperti titik asal replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin.[6]
Contoh enzim 6-cutters adalah HindIII (AAGCTT) yang memotong genome bakteriofage
lambda (48 kbp) pada 7 situs.[6]
8-cutters
Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida; cocok digunakan
untuk membentuk kromosom menjadi potongan-potongan yang spesifik dalam ukuran yang
besar.[6] Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters) memotong-motong kromosom E. coli
menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI (enzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian.[6] Jika
langsung menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan
banyak.[6] Untuk itu digunakan enzim 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan
menggunakan enzim 6-cutters.[6]
4-cutters
Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan pemotongan pada beberapa
situs yang potensial.[6] Contohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan
pada potongan tersebut terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial
(partial digestion) menggunakan enzim 4-cutters.[6]
Penamaan Enzim Restriksi
Pada dasarnya, penamaan enzim restriksi diambil dari nama bakteri yang menghasilkan
enzim tersebut. Seperti contohnya enzim EcoRI yang memiliki pola:[1]
Kependekan Kepanjangan Deskripsi
E Escherichia genus
co coli species
R RY13 strain
I Urutan penemuan Urutan enzim yang ditemukan pada bakteri
Jenis-jenis enzim restriksi
Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan komposisi subunit, posisi
pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan:[7]
Enzim restriksi tipe I
Enzim restriksi ini kompleks dengan multisubunit, memotong DNA secara acak dan jauh dari
sekuens pengenalannya.[7] Pada awalnya enzim ini dikira langka; tetapi setelah analisis
sekuens genom, enzim ini ternyata umum.[7] Enzim restriksi tipe I ini memiliki pengaruh
besar dalam biokimia, tetapi mempunyai nilai ekonomis yang rendah karena tidak dapat
menghasilkan potongan fragmen DNA yang diinginkan sehingga tidak diproduksi.[7]
Enzim restriksi tipe II
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

Enzim ini memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan. [7] Enzim ini menghasilkan
fragmen-fragmen sesuai dengan yang diinginkan sehingga biasa digunakan untuk analisis
DNA dan kloning gen.[7] Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI,
dan NotI; dan enzim-enzim tersebut tersedia secara komersil. [7] Enzim ini tergolong kecil
dengan subunit yang memiliki 200-350 asam amino dan memerlukan Mg2+ sebagi kofaktor.[7]
Selanjutnya enzim jenis tipe II yang umum, biasanya digolongkan sebagai tipe IIs, adalah
FokI dan AlwI.[8] Enzim ini memotong di luar situs pengenalan, berukuran sedang, 400-650
asam amino, dan memiliki 2 domain khusus.[8] Domain pertama untuk berikatan dengan
DNA, sedangkan domain yang satunya untuk memotong DNA.[8]
Enzim restriksi tipe III
Enzim restriksi tipe II ini merupakan enzim restriksi yang tidak digunakan dalam
laboratorium.[8] Hal ini dikarenakan enzim ini memotong di luar situs pengenalan dan
membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk
menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna.[8]
Keadaan Restriksi
Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7,4; suhu 37 °C; dan memerlukan
bermacam-macam kekuatan ionik, tergantung dari jenis enzimnya.[8] Akan tetapi, beberapa
enzim memerlukan optimasi khusus agar proses restriksi berjalan dengan baik. [8] Dalam
larutan stok, enzim restriksi biasanya dikemas bersama dengan 10X larutan penyangga reaksi
yang telah dioptimasi.[8] Buffer reaksi dapat digolongkan menjadi empat jenis berdasarkan
kekuatan ionik-nya:[8]
1. 0 mM NaCl = low salt buffer (L)
2. 50 mM NaCl = medium salt buffer (M)
3. 100 mM NaCl = hi salt buffer (H)
4. 150 mM NaCl = very high salt buffer (VH)
Ketika melakukan digesti dengan 2 atau lebih enzim restriksi yang berbeda buffer reaksinya,
perlu dilihat rujukan tabel aktivitas enzim tersebut pada buffer reaksi tertentu.[8] Misalnya:
reaksi digesti dilakukan dengan menggunakan EcoRI (garam tinggi) dan HpaII (garam
rendah, KCl).[8] Setelah dilihat pada tabel, kedua enzim aktif pada keadaan garam sedang.[8]
Oleh karena itu, digunakan buffer reaksi dengan konsentrasi KCl sedang. [8] Buffer reaksi
yang digunakan adalah KCl karena HpaII memerlukan KCl, bukan NaCl; sedangkan EcoRI
dapat menggunakan kedua garam tersebut.[8] Kondisi optimal ketika melakukan proses digesti
sangat penting.[8] Karena jika kondisi optimal tidak tercapai, enzim akan memotong secara
tidak normal.[8] Contohnya: EcoRI pada buffer reaksi dengan konsentrasi garam rendah tidak
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

hanya memotong pada situs pengenalan normal GAAATTC, tetapi akan juga memotong situs
pengenalan AATT. Aktivitas seperti ini dinamakan star activity.[8]
Hasil Pemotongan Enzim Restriksi
Enzim restriksi yang biasa digunakan dalam laboratorium biologi molekuler memotong
molekul DNA pada situs pengenalan dan menghasilkan salah satu dari ketiga jenis pola hasil
pemotongan.[5] Ketiga pola hasil pemotongan enzim restriksi sebagai berikut:[5]
Ujung menggantung 5’
Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil
pemotongan memanjang pada ujung 5’.[5] Contoh enzim yang menghasilkan ujung
menggantung 5’ adalah BamHI

Ujung menggantung 3’
Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, tetapi
menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’.[5] Contoh enzim yang
menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI

Ujung tumpul
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung
tumpul.[5] Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI

Pola ujung menggantung, baik yang 3’ ataupun 5’, sering disebut juga dengan ujung lengket
(sticky ends) atau ujung kohesif (cohesive ends).[5] Pola seperti ini lebih mudah menempel
(annealing) dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang
menggantung.[5]
Menghentikan Proses Digesti
Setelah proses inkubasi selesai, reaksi digesti enzim dapat dihentikan dengan menambahkan
EDTA.[8] Penambahan EDTA akan mengkelat ion logam; dalam reaksi ini ion logam yang
dikelat adalah Mg2+.[8] Untuk beberapa tipe enzim lainnya, inaktivasi dapat dihentikan dengan
cara pemanasan; menggunakan pendenaturasi protein, contohnya fenol atau kloroform; atau
memisahkan enzim dari DNA menggunakan kolom kromatografi.[8]
Contoh Enzim Restriksi
Enzim restriksi yang umum digunakan berasal dari tipe II, berikut contohnya:[9]
Subtype Contoh Situs Pengenalan
GAATTC
Orthodox EcoRI
CTTAAG
GATATC
EcoRV
CTATAG
GCCNNNNNGGC
BglI
CGGNNNNNCCG
GGATGN9NNNN
Type IIS FokI
CCTACN9NNNN
GCGCGC
Type IIE NaeI
CGCGCG
GCCGGC
Type IIF NgoMIV
CGGCCG
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

CCTNAGC
Type IIT Bpu10I
GCANTCG
CCNNNNNNNGG
BslI
GGNNNNNNNCC
CTGAAGN14NN
Type IIG Eco57I
GACTTCN14NN
NNN10CGATN6TGCN10NN
Type IIB BcgI
NNN10GCTN6ACGN10NN
NN4N8GAGN5CTCN8N4N
BplI
NN4N8CTCN5GAGN8N4N
Gm^ATC
Type IIM DpnI
CTm^AG
^nukleotida yang termetilasi

Asam nukleat baik DNA maupun RNA mampu dipotong dengan menggunakan suatu enzim
yaitu nuklease. Enzim nuklease yang mampu memotong RNA disebut ribonuklease atau
Rnase, sementara enzim yang mampu memotong DNA disebut deoksiribonuklease atau
Dnase. Beberapa nuklease hanya memotong urutan asam nukleat yang single strand dan apa
pula yang mampu memotong asam nukleat yang double strand. Nuklease ada dua macam
yakni eksonuklease yang mampu memotong molekul asam nukleat single strand atau
beberapa oligonukleotida pendek yang hanya mengenali salah satu ujung asam nukleat, yaitu
ujung 5′ atau ujung 3′; sementara endonuklease mampu memotong asam nukleat di dareah
tengah daru sekuens asam nukleat yang mampu mengenali daerah spesifik pada urutan asam
nukleat (Clark, 2010; Howe, 2007; Murray et al., 2009).
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

Enzim restriksi endonuklease adalah enzim yang berperan untuk memperoleh suatu urutan
DNA dengan memotong genom DNA menjadi fragmen-fragmen dengan cara memotong
ikatan fosfodiester pada untaian DNA. Enzim restriksi yang diproduksi oleh bakteri
dinamakan endonuklease yang secara tipikal mampu mengenali 4 – 8 bp urutan nukleotida
yang spesifik. Urutan nukleotida yang spesifik tersebut dinamakan restriction sites yang
secara umum merupakan sekuens palindromic (run back) yang pendek dengan pola urutan
sekuens yang sama ketika dibaca pada arah 5′ → 3′ (Howe, 2007; Lodish et al., 2003; Ream
et al., 2003). Enzim restriksi endonuklease dimanfaatkan untuk proses memotong daerah
DNA tertentu. Pada Gambar 1 ditunjukkan enzim restriksi EcoRI yang mampu mengenali
enam urutan nukleotida spesifik yang kemudian dipotong menjadi dua. Sementara beberapa
contoh enzim restriksi dengan daerah spesifiknya disajikan pada Tabel 1.

Gambar 1. Suatu double strand dari DNA yang dipotong oleh enzim restriksi EcoRI (Lodge
et al., 2007).
Tabel 1. Beberapa contoh endonuklease dengan daerah spesifiknya (Lehninger et al., 2000).

Enzim restriksi endonuklease dibagi menjadi tiga tipe dengan karakteristik yang berbeda-
beda dan disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Karakteristik dari masing-masing tipe endonuklease (Howe, 2007; Reece, 2004).
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

Adapun cara kerja enzim endonuklease tersebut berbeda-beda. Enzim endonuklease tipe II
telah diketahui strukturalnya yang sisi katalitiknya tersusun atas 5 macam protein sekunder
dalam bentuk β-sheet yang diapit oleh 2 protein sekunder dalam bentuk α-heliks (Gambar 2).
Enzim restriksi endonuklease tersebut dapat melakukan ‘scanning’ pada untain molekul DNA
jika tidak menemukan restriction sites yang spesifik. Peristiwa tersebut dinamakan
mekanisme sliding. Mekanisme sliding tersebut melibatkan pergerakan di sepanjang lekukan
DNA.  Namun enzim restriksi endonuklease tersebut akan mengubah konformasinya ketika
mengenali daerah restriction sites yang spesifik. Ketika sudah mengenali daerah spesifik,
maka enzim tersebut akan memotong dua ikatan gula deoksiribosa dengan fosfat dari double
helix DNA yang berbeda dan menghasilkan gugus 3′ hidroksil (OH) dan gugus 5′ fosfat
(PO4–). Selanjutnya DNA tersebut menjadi fragmen-fragmen yang sesuai dengan daerah
pemotongannya. Enzim endonuklease tidak selamanya memotong DNA menjadi fragmen
yang ujungnya simetris (blunt ends), namun ada juga yang ujungnya asimetris (sticky ends)
(Gambar 3). Pola potongan simetris  atau tidaknya tergantung kinerja enzim endonuklease
seperti yang tertera pada Tabel 1(Allison, 2007; Reece, 2004).
Gambar 2. Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim tersebut mengenali
double strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya memecah
ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa dua fragmen yang ujungnya
sticky ends. Pada gambar tersebut warna hijau dan biru menunjukkan subunit protein dimer
yang identik (Reece, 2007).
NAMA : MUHAMMAD HIKAM ”BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
NIM : F1C117021

 Gambar 3. Contoh pola pemotongan enzim restriksi endonuklease. Enzim tersebut

menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan formasi 5′–PO 4– dan 3′–OH yang
bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends (BamHI) dan bentuk simetris atau
blunt ends (SmaI) (Allison, 2007).

Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam prosedur
protokol restriksi suatu sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation bivalen Mg 2+ dari MgCl
tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan
aktivitas enzim restriksi (Ausubel, 2003; Reece, 2004). Adapun kinerja enzim BamHI
tersebut mampu memotong ikatan fosfodiester pada urutan DNA pada sisi: 
5′ G↓G-A-T-C-C 3′
3′ C-C-T-A-G↑G 5′

Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G), sehingga
BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh enzim BamHI berupa formasi
5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel,
2003; Becker et al., 1996).
Enzim BamHI bekerja dengan cara melakukan scanning sekuens non-spesifik di
sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelah itu ketika enzim tersebut
menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa konformasinyan
dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara nukleotida G menjadi
fragmen yang terpisah (Allison, 2007).