REAKSI ANTIGEN DENGAN
ANTIBODI IN VITRO
Sujudi, Suharto, dan A. Soebandrio
Salah satu sifat dari antibodi ialah kemampuan
bereaksi secara khas dengan antigen yang menim-
bulkannya. Dikenal beberapa jenis antibodi di
dalam istilah yang dipakai sehari-hari:
1.. Antitoksin:
antibodi terhadap toksin atau toksoid, de-
ngan reaksi bersifat netralisasi atau menim-
bulkan flokulasi.
2. Aglutinin:
antibodi yang menggumpalkan sel (aglutinasi).
Aglutinin bereaksi dengan antigen berben-
tuk partikel (suspensi) atau dengan antigen
yang diadsorpsikan pada permukaan partikel
seperti sel darah merah,latex dan lain-lainnya'
3. Presipitin:
antibodi yang menimbulkan presipitasi (pe-
ngendapan) dengan antigen berbentuk larutan.
4. Lisin:
antibodi yang menyebabkan lisis sel.
5. Opsonin:
antibodi yang setelah melekat pada kuman
atau partikel lainnya, merangsang dan memu-
dahkan fagositosis.
107
6. Antibodi netralisasi:
menetralisir daya infeksi kuman atau virus.
Serologi adalah ilmu yang mempelajari reaksi
ant^r^ antigen dengan antibodi di dalam serum.
Reaksi serologi dapat dipakai untuk:
a. Menentukan antigen atau antibodi jika salah
satu dari hal tersebut telah diketahui
b. Mengukur kadar atau titer.
Maka reaksi serologi dapat dipakai untuk
menentukan jenis kuman yang diasingkan dari
penderita; menentukan golongan darah sebelum
melakukan transfusi darah; memilih donor yang
tepat pada transplantasi j aringan dan seterusnya.
Reaksi presipitasi
Bila antigen dalam bentuk larutan dicampur de-
ngan antiserum, maka akan terjadi presipitasi.
Bila disediakan sederetan tabung dengan antise-
rum yang volumenya sama dan pada tabung-
tabung itu ditambahkan antigen dalam jumlah
yang makin banyak, maka akan ditemukan pre-
sipitasi pada tabung y^ng sudah cukup ditam-
bahkan antigen. Bila setelah pengeraman tabung-
tabung itu dipusing dan endapan dipisahkan dan
ditimbang, maka akan ditemukan bahwa di
108 Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran

tabung-tabung pertama tidak terdapat endapan,
kemudian didapat endapan yang makin banyak
sampai mencapai maksimum dan kemudian
mulai berkurang lagi. Keterangannya adalah di
dalam tabung-tabung pertama masih terdapat
kelebihan antibodi, dan semua determinan anti-
gen akan terikat oleh molekul imunoglobulin.
Presipitasi terjadi karena timbulnya anyaman
(anice) antara imunoglobulin dan antigen. Pada
tabung-tabung selanjutnya terdapat kelebihan
Kekuatan yang mengikat antigen pada anri
bodi:
1,. Tenaga Coulomb:
berdasar atas daya tarik antara benda dengan
tegangan beftentangan, tenaganya berban-
ding terbalik dengan jarak pangkat dua.
2. Ikatan H (Hydrogen bonding):
terbentuknya ikatan dengan perantaraan H
antar a bentuk-bentuk hidrofil seper-ti - ".;
"

antigen dan tidak dapat dibentuk anyaman yang "i{: !.. *i.i':r.-:irl yang relatil lemah dan
sempurna sehingga presipitasi berkurang (libat reversibel.
Gambar 16.I dan 16.2).

)-( *-t-*.H
I
I
l

(a)
>----4
+)*(
I
I
I I
J_-_.
It
o9
_J* t ?

(b)
,---.{+---
{*,-**>*-(*
(c)

Gambar 16.1 Kemungkinan pembentukan kompleks antara suatu antigen ber-valensi .-0., $
dengan antibodi;nang bivalen. r-<
(a) Kompleks dalam keadaan kelebihan antibodi. Semua determinan antigen terikat, presipitasi negatif.
(b) Anyaman oleh antigen dan antibodi dibentuk bila perbandingan seimbang, presipitasi posirif.
(c) Kompleks dalam keadaan kelebihan antigen, dengar, p"rbrnding"n, pr"sipir"ri krrr"rrg.
-r.r---"."-

Gambar 16.2 Pembentukan presipitat pada reaksi antigen-antibo di in vitro.
3. Tenaga Van der Waals:
ditentukan oleh kekuatan-kekuatan tarik
antara lapisan elektron yang meliputi dua
susunan molekul. Kekuatannya berbanding
terbalik dengan jarak berpangkat 7.
Reaksi presipitasi ju ga dapat dilakukan dengan
mengalirkan secara pelan larutan antigen di
ataslarvtan antibodi sehingga terdapat dua lapis
dengan permukaan perremuan di antaranya.
Oleh karenaterjadi difusi dari kedua bahan itu
maka pada suatu tempat akan tercapai konsen-
trasi optimal untuk rcrjadinya presipitasi dan
presipitasi ini akan tampak sebagai cincin purih di
dalam tabung.
Reaksi' presipitasi dalam gel
Reaksi presipitasi juga dapat dilakukan di dalam
medium yang semisolid yang disebut gel, misal-
nya yang lembek.
^gar
Reaksi Antigen dengan Antibodi In Vitro 109
Difusi ganda menurut Ouchterlony
(double diffusion method)
Antigen dan antibodi dimasukkan di dalam dua
lubang kecil di dalam agar sehingga kedua
bahan itu akan berdifusi dan pada titik per-
temuan di mana terdapat perbandingan kon-
sentrasi optimal akan terjadi presipitasi berupa
garis putih.
Bahan yang mengandung beberapa antigen
akan memberi reaksi dengan serum yang me-
ngandung antibodi terhadap setiap antigen itu
dan karena adanya perbedaan kecepatan difusi
dari antigen, akan membentuk beberapa garis
sesuai dengan antigen-antigen itu. Persamaan
antigen di dalam dua larutan dapat diperlihat-
kan dengan mereaksikan kedua antigen itu
dengan saru antibodi. Garis tengah yangberga-
bring secara teratur menunjukkan persamaan
;';:;:i:.:,r;.:::rrri":rl.;:.;..::: i;:'t:;-,:. Antigen-antigen yang
110 Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran
Aga
/";\
Aga
Aba
Abc
Gambar 16.3 Difusi ganda menurut Ouchteriony
mempunyai persamaan tidak lengkap mung-
kin menunjukkan jalur (spur). Antigen-antigen
yang sama sekali berlainan akan memberi
dua garis yang saling menyilang (ihat Gambar
16.3).
Difusi tunggal radial
Antibodi telah dicampurkan di dalam agar. Anti-
gen yang dimasukkan di dalam lubang akan ber-
difusi dan bereaksi dengan antibodi memben-
tuk lingkaran presipitasi putih. Diameter ling-
karan dapat dipakai sebagai ukuran konsentrasi
antigen, bila dibandingkan dengan larutan anti-
gen yang diketahui konsentrasinya.
lmunoelektroforesis
Pemeriksaan antigen dapat dilakukan dengan
memasukkan antigen di dalam lubang di agar
dan kemudian menyalurkan arus listrik melalui
agar itu, yang mengakibatkan pemisahan dari
berbagai fraksi protein di dalam larutan antigen.
Bila kemudian fraksi-fraksi ini direaksikan de-
ngan antibodiyangdiketahui, maka fraksi yang
sesuai akan menunjukkan presipitasi. Ada ber-
bagai cara untuk mengerjakan imunoelektro-
foresis, seperti: counter cltrrent electropboresis,
rock et electrophoresis, truo-dimensional immunoe-
lectr oph ore sls dan seb ag ainy a.
*'x*'
Abc
Reaksi aglutinasi
Reaksi aglutinasi adalah reaksi antara antibodi
dengan antigen yang terdapat di permukaan sel
sehingga dibentuk anyaman melalui ikatan silang
antara sel-sel itu dengan perant^r^an antibodi.
Reaksi aglutinasi dipakai untuk determinasi
kuman dan untuk mengetahui tipe dari sel ter-
tentu misalnya pada penentuan golongan darah.
Reaksi aglutinasi dapat juga dipakai untuk pe-
nentuan antibodi di dalam serum, bahkan titer-
nya; dengan memakai misalnya kuman yang
sudah diketahui sebagai antigen.
Reaksi aglutinasi dapat dikerjakan secara
makroskopik di dalam tabung-tabung aglutinasi,
atau dikerjakan secara mikroskopik pada gelas
alas dengan mencampurkan setetes antiserum
dengan setetes suspensi kuman dan diperiksa
dengan mikroskop bila perlu. Carayangdisebut
belakangan juga disebut spot agglutination atau
slide agglutination.
Jenis aglutinasi H, O dan Vi
Weil Felix (1917) menemukan bahwa antigen
dari badan kuman Proteus (antigen O, antigen
somatik) berlainan dengan antigen dari flagel
(antigen H) dan hasil aglutinasinya jelas berbeda.
Antibodi H didapat dengan cara menyuntik-
kan kuman yang masih bergerak, dalam bentuk

suspensi kuman hidup atau dimatikan dan anti-
gen somatiknya dirusak dengan formalin, ke
dalam binatang percobaan. Ttter yang didapat
biasanya tinggi karena antibodi-H mempunyai
afinitas tinggi terhadap flagel dan mudah menye-
babkan bergerombolnya flagel. Pada manusia,
titer yang tinggi menunjukkan adanyainfeksi atau
pernah divaksinasi, tetapi tidak ada hubungan-
nya dengan derajat kekebalan karena antigen H
tidak berhubungan dengan virulensi.
AntibodiO didapat den gan caramenyuntik-
kan kuman yang flagelnya telah dirusak dengan
mencampurkan alkohol dan dieram pada 37"C
selama 24-36 jam. Biasanya titer yang didapat
tidak begitu tinggi karena untuk aglutinasi sel
kuman diperlukan lebih banyak molekui antibodi.
Antibodi-Vi hanya terdapat pada kuman yang
baru diasingkan dan terbatas pada Salmonella
typhosd serta beberapa jenis Salmonella lainnya
dan kuman enterik nonpatogen. Vi, kependekan
dari virulensi, pada mulanya dianggap sebagai
faktor penting untuk menentukan virulensi
kuman, tetapi kemudian ternyata antigen Vi
tidak sepenting antigen O. Adanya antigen Vi
pada bagian luar permukaan sel kuman dapat
menghambat reaksi aglutinasi dengan serum yang
mengandung antibodi-O. Antigen Vi dapat di-
hilangkan dengan cara pembiakan berulang kali.
Reaksi silang (cross reaction) pada reaksi
aglutinasi
Permukaan sel kuman mengandung beberapa
macam antigen dan ada kemungkinan bahwa
satu antigen , .yang serupa atag :hampir senrPa,
Reaksi Antigen dengan Antibodi In Vitro lll
ditemukan pada dua jenis kuman. Serum yang
mengandung antibodi terhadap satu kuman
mungkin memberikan reaksi aglutinasi dengan
kuman lain, sehingga disebut aglutinasi silang.
Reaksi silang akan mempersulit diagnosis
kuman dengan cara aglutinasi. Untuk mengatasi
ini diperlukan serum yang mengandung anti-
bodi runggal terhadap salah satu antigen, disebut
serum monovalen, dan dengan berbagai macam
serum monovalen kemudian dapat dibedakan
kuman yang satu terhadap lain karena setiap
jenis kuman mempunyai kombinasi antigen
yang berlainan.
Dalam beberapa hal reaksi silang dapat meng-
untungkan, misalnya reaksi silang antara kuman
Proteus dan Rickettsia. Bila pada seorang terda-
pat antibodi terhadap Rickettsia maka serumnya
akan menunjukkan aglutinasi dengan kuman
Proteus strain tertentu dan oleh karena pem-
biakan Rickettsia untuk pembuatan antigen tidak
semudah pembiakan Proteus, maka pemerik-
saan aglutinasi dikerjakan dengan kuman ini
(reaksi dari Weil-Felix).
Hemaglutinasi
Hemaglutinasi berarti aglutinasi sel darah merah.
Ternyata dasar hemaglutinasi mungkin berlain-
an satu sama lain, dan dapat dijelaskan sebagai
berikut:
a. Hemaglutinasi yang disebabkan oleh anti-
bodi terhadap antigen pada permukaan sel
darah merah. Misalnya untuk menentukan
golongan darah dapat dilakukan reaksi
hemaglutinasi. Juga pada beberapa penyakit
112 Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran
timbul antibodi terhadap sel darah merah
golongan O yang dapat bereaksi pada suhu
rendah, disebut aglutinasi dingin.
b. Hemaglutinasi yang disebabkan oleh virus
atau Rickettsia. Reaksi ini disebabkan karena
pada permukaan sel darah merah terdapat
reseptor khas untuk virus atau Rickettsia.
Pada reaksi ini antibodi tidak mempunyai
peranan, bahkan antibodi dapat mengham-
bat reaksi ini dalam suatu percobaan yang
disebut reaksi hambatan hemaglutinasi: . .
:-
c. Hemaglutinasi di mana sel darah merah hanya
berfungsi sebagai pembawa antigen. Sel darah
merah binatang tertentu dapat dilapiskan
dengan antigen setelah permukaannya di-
ubah sifatnya dengan asam tannin atau kro-
mium klorida. Setelah antigen menempel
pada permukaan sel darah merah, antigen ini
dapat ditentukan dengan serum yang sesuai.
Keuntungan dari reaksi ini adalah memudah-
kan melihat hasil reaksi karena dilakirkan
dengan partikel-partikel yang besar. Reaksi
ini juga disebut
Reaksi pengikatan komplemen
(com plement fixation test)
Komplemen dapat melekat pada kompleks
antigen-antibodi, dan bila antigen tidak berupa
sel maka pengikatan komplemen ini tidak dapat
dilihat begitu saja. Untuk membuktikan adanya
pengikatan komplemen diperlukan suatu indi-
kator yang terdiri dari campuran suspensi sel
darah merah kambing dan larutan .:,;:,:::...,,
atau serum yang mengandung antibodi terhadap
sel darah merah kambing, jadi suatu indikator
berupa .:'*::r j.:':,:-'t",.i r',; ji':.
Tahap-tahap reaksi pengikatan komplemen
adalah sebagai berikut:
Tahap 1 : Dicampurkan antigen dengan anti-
-
bodi. Salah satu dari kedua bahan
ini telah diketahui. Bila ingin me-
ngetahui adanya antibodi maka di-
pakai antigen yang diketahui, dan
sebaliknya.
Ditambahkan komplemen.
-
Bila antibodi sesuai dengan anrigen
dan membentuk kompleks, maka
komplemen akan terikat; bila kom-
pleks antigen-antibodi tidak ter-
bentuk, maka komplemen masih
bebas di dalam larutan.
Tahap 2: - Ditambahkan sel darah merah dan
antibodinya sebagai
indikator untuk mengetahui apa-
kah masih ada komplemen bebas di
dalam larutan.
Pada pembacaan akan terlihat:
Reaksi positif:
tidak ada hemolisis karena komplemen telah
terikat pada kompleks antigen-antibodi yang
sesuai.
Reaksi negatif:
hemolisis karena komplemen tidak terikat
bila antigen tidak sesuai dengan antibodi dan
tidak dibentuk kompleks.

Yang harus diperhatikan pada reaksi peng-
ikatan komplemen adalah
Serum yang diperiksa harus dipanaskan da-
^. hulu pada suhu 56oC selama 30 menit, untuk
membuat inaktif komplemennya.
b. Kekuatan komplemen harus diukur dengan
titrasi terhadap sel indikator. Satu unit kom-
plemen ialah jumlah komplemen terkecil
yang dapat menyebabkan hemolisis total
pada standard sensitized cells padawaktu dan
suhu tertentu (juga disebut exd.ct unit). Kol-
mer menyebut jumlah komplemen pada
tabung sesudah tercapai end-point titrasi se-
bagai satu fwll unit. Untuk pekerjaan sehari-
hari dianjurkan memakai duafull unitberda-
sarkan pengalaman. Titrasi komplemen dila-
kukan pada hari yang sama dengan dilakukan-
nya reaksi pengikatan komplemen karena
komplemen tidak dapat disimpan lama karena
titernya akan berubah dari hari ke hari.
c. Kontrol terhadap serum penderita.
Beberapa serum mempunyai sifat anti-kom-
plemen, yang berarti membuat inaktif kom-
plemen, yang sebabnyatidak diketahui dan
sering ditemukan pada serum yang telah di-
simpan agak lama. Sifat ini diperiksa dengan
tidak menambahkan antigen pada tabung
kontrol sehingga tabung itu harus menun-
jukkan hemolisis lengkap. Bila ada faktor
anti-komplemen, hemolisis tidak terjadi dan
pada reaksi sesungguhnya hasilnya akan
sama dan dibaca positif.
Reaksi Antigen dengan Antibodi In Vitro 113
d. Kontrol terhadap antigen.
Juga terhadap antigen diperiksa kemung-
kinan adanya sifat anti-komplemen. Cara
pemeriksaa nnya jugadengan tabung kontrol
yang berisi antigen tanpa diberi antibodinya.
Anti-komplemen akan menghasilkan hemo-
lisis negatif yang akan terbaca pada perco-
baan sebagai positif yang salah. Efek ini dapat
dihilangkan dengan pengenceran antigen.
Reaksi pengikatan komplemen banyak dipa-
kai pada pemeriksaan serologi sehari-hari untuk
berbagai penyakit, seperti pemeriksaan \Tasser-
mann untuk membantu diagnosis penyakit sifilis,
pemeriksaan adanya antigen Australia yang di-
hubungkan dengan virus hepatitis, dan pemerik-
saan auto-antibody terhadap antigen sel tubuh.
lmunofluoresensi
Zat w arna yang berfluoresensi, seperti fluoresein
dan rodamin, dapat digabungkan pada antibodi
tanpa mempengaruhi sifatnya yang khas. Kom-
pleks antibodi dengan z tw^rnaini akan tetap me-
ngikat antigen dan bila dilihat dengan mikroskop
ultraviolet akan tampak fluoresensi. Ada beberapa
cara untuk melakukan pewarnaan fluoresensi:
I. Fluoresensi langsung (direct test)
Antibodi digabungkan dengan zat warna ber-
fluoresensi (fluorokrom) dan konjugat ini
dipakai untuk mendeteksi antigen. Misalnya
pada sediaan mikroskopik lendir hapus teng-
gorok ingin diketahui adarya kuman pneu-
mokokus, maka sediaan tadi diwarnai dengan
ll4 Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran
antibodi terhadap polisakarida pneumoko-
kus yang dilabel dengan fluorescein-isotbio-
cyandte. Bila positif, maka dengan mikros-
kop ultraviolet dapat dilihat kuman pneu-
mokokus berfl uoresensi.
2. Fluoresensi tidak langsung (indirect test)
Antigen direaksikan dahulu dengan antibodi
untuk kemudian diwarnai dengan konjugat
terdiri dari antiimunoglobulin dan fluoro-
krom. Misalnya pada percobaan di atas, sedia-
an hapus tenggorok direaksikan dahulu de-
ngan serum kelinci yang mengandung anti
bodi terhadap kuman pneumokokus. Sete-
lah dicuci, sediaan diwarnai dengan anti-Ig
kelinci yang dilabel dengan fluoresein. Hasil-
nya di bawah mikroskop ultraviolet akan
tampak kuman pneumokokus berfl uoresensi.
Teknik ini mempuny ai beb er apakeuntungan
karena selain memberikan fluoresensi yang
lebih terang, cukup disediakan satu macam
konjugat antilg kelinci yangdapat memberi
fluoreser,rsi pada berbagai macam antibodi
kelinci terhadap macam-macam kuman.
3. Teknik sandwich
Misalkan kita ingin melihat berapa banyak
sel limfosit yang membuat antibodi terhadap
polisakarida kuman pneumokokus. Dibuat
sediaan sel limfosit dan difiksasi dengan
etanol. Kemudian disiram dengan larutan
yang mengandung polisakarida pneumo-
kokus, dibiarkan sebentar dan kemudian
dicuci untuk menghilangkan zat yang tidak
menempel pada limfosit. Setelah itu diberi
larutan antibodi terhadap polisakarida yang
dilabel sehingga sel limfosit yang mengikat
polisakarida karena membuat antibodi ter-
hadapny a akan tamp ak berfl uoresensi.
Rad io-i mmunoassay (RlA)
Mula-mula dibuat kurva standar dengan anrigen
dan antibodi yang diketahui. Untuk mengetahui
kadar antibodi, antibodi tersebut dicampurkan
dengan antigen berlabel yang jumlahnya diketa-
hui. Kemudian antigen yang bebas dipisahkan
dari antigen yang terikat pada antibodi, kekuatan
radioaktif antigen yang terikat pada antibodi di
ukur dan hasilnya dimasukkan pada kurva stan-
dar. Dari hasil tersebut akan diketahui kadar anti
bodi. Dengan cara yang sama dapat diketahui
kadar antigen, yaitu dengan mereaksikannya de-
ngan antibodi berlabel yang kadarnya diketahui.
Teknik-teknik lain
A. Menggunakan enzim seperti fosfatase dan
peroksidase untuk melabel antibodi.
Dasar teknik ini sama'dengan pewarnaan
imunofluoresensi. Bedanya, sebagai label di-
gunakan enzim. Untuk dapat melihat hasil
reaksi digunakan substrar dari enzim ter-
sebut. Hasilnya dapat dilihat dengan mikros-
kop cahaya biasa.
B. Menggunakan label feritin.
Teknik ini terutama digunakan untuk mi-
kroskop elektron.
C. Enzyme Linked Immunosorbmr Asay @LISA).
Dapat digunakan untuk mendeteksi baik
antigen maupun antibodi dari suatu larutan.
 Reaksi Antigen dengan Antibodi In Vitro 115

Misalnya: - Substrat ditambahka n yang akan di

- Antigen dilekatkan padazatpadat (plas- degradasi oleh enzim.
tik), lalu dicuci. Teliti perubahan warna substrat, sesuai
-
dengan jumlah antibodi di dalam cair-
-Tambahkancairanyangdidugamengan- an uji'
dung antibodi yang homolog, eramkan
lalu cuci.

- Antiimunoglobulin yang dilabel ditam-

bahkan, biarkan bereaksi kemudian
cuci.