DIAGNOSTIK MOLEKULER

MATRIKS SIMILARITAS DNA

OLEH :

KELOMPOK VI

MUHAMMAD FARIDZ ARIFIN

FENNY PUTRI ALLO LATORUMO

HESTI MONICA

FADHILLAH

HAMDINA

PROGRAM STUDI D-IV ANALIS KESEHATAN

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN MADALA WALUYA
KENDARI
2018
 MATRIKS SIMILARITAS

A. Tujuan :
1. Untuk menentukan jenis fragmen DNA atau gen berdasarkan urut-urutan
nukleotida hasil sekuensing.
2. Untuk mengetahui kerja analisis penyejajaran dan pembuatan pohon
filogenetik.
B. Tinjauan Pustaka
Keanekaragaman mikrobia yang meliputi bakteri, khamir, dan kapang
dapat diklasifikasikan berdasarkan similaritas karakter, DNA fingerprinting,
atau sekuens gen 16s rRNA. Pada sistematika modern dikenal ada 3 cara
klasifikasi,yaitu klasifikasi numerik-fenetik, klasifikasi kimiawi, dan
klasifikasi molekular. Kombinasi antara sistem klasifikasi dengan
menggunakan ketiga pendekatan tersebut dikenal sebagai system klasifikasi
polifasik yang akan menghasilkan sistem klasifikasi yang kongruen (Priest
and Austin, 2007).
Konsep spesies yang digunakan dalam taksonomi mikrobia antara lain:
konsep taksospesies, konsep genospesies, konsep genomik, dan konsep
filofenetik. Konsep taksospesies berdasarkan metode taksonomi numerik dan
mendefinisikan organisme (strain dan isolate) memiliki similaritas fenotipik
yang sama. Konsep genospesies merupakan grup bakteri yang dapat bertukar
gen-gen. Konsep genomik merupakan grup dari spesies yang menunjukkan
nilai hibridisasi tinggi (70% DNA-DNA Relatedness). Konsep filofenetik
merupakan organisme yang menunjukkan similaritas tinggi dari karakter-
karakter yang independen. Phylogeny tree merupakan genealogi (silsilah) atau
diagram yang melacak kemungkinan hubungan evolusioner di antara
kelompok-kelompok taksonomik. Catatan fosil dan anatomi perbandingan
dapat digunakan untuk konstruksi phylogeny tree, tetapi dapat pula digunakan
metode lain yakni membandingkan DNA dan protein spesies-spesies yang
akan dibuatkan silsilah (Campbell et al., 2005). Analisis sekuens gen 16s
rRNA biasa digunakan pada taksonomi modern mikrobia, karena dapat
menentukan hubungan kekerabatan antar taksa yang berjauhan, dan dapat
digunakan untuk membedakan antara genus dan spesies. Klasifikasi yang
digunakan pada percobaan ini adalah klasifikasi molekular menggunakan data
molekular yang berasal dari materi genetik, antara lain data sekuens DNA,
DNA hibridisasi, atau DNA fingerprinting . Klasifikasi molekular dapat
mengetahui perbedaan antar strainmikrobia secara filogenetik. Metode
klasifikasi tersebut biasa menggunakan sekuens gen 16s rRNA (Satyanarayana
& Johri, 2005).
 Filogenetik molekuler merupakan cabang ilmu yang sedang sangat
berkembang, digunakan pada hampir seluruh cabang ilmu biologi (Yang dan
Rannala, 2012). Filogenetik molekuler merupakan teknik yang
mengkombinasikan metode molekuler dan statistik dalam menentukan
hubungan kekerabatan secara evolusi antar organisme atau gen menggunakan
struktur dan fungsi molekul beserta informasi perubahannya terhadap waktu.
Kemajuan teknologi dan algoritma-algoritma statistik yang telah diciptakan
membuat proses sekuensing genom menjadi lebih cepat, murah, dan efektif.
Dengan banyaknya data genom yang dipublikasikan, hal ini membuat
filogenetik molekuler terus berkembang dan memberikan banyak aplikasi.
Tujuan utama analisis filogenetik molekuler adalah menganalisis adanya
proses evolusi dan menyajikannya dalam bentuk pohon filogenetik yang
secara grafis menunjukkan kekerabatan antar spesies atau gen terhadap waktu
(Dowell, 2008).
Pohon filogenetik dikenal pula dengan istilah filogeni. Filogeni
merupakan diagram berupa pohon yang menunjukkan garis evolusi dari
spesies, organisme, atau gen berbeda dari suatu nenek moyang bersama.
Filogeni sangat bermanfaat dalam mengetahui diversitas biologis, menyusun
klasifikasi, dan menjelaskan fenomena yang terjadi selama proses evolusi
(Baum, 2008). Hubungan kekerabatan antar spesies atau gen dapat dijelaskan
dengan filogeni yang merupakan hasil analisis filogenetik molekuler (Yang
dan Rannala, 2012). Oleh karena itu, filogenetik molekuler digunakan sebagai
pendekatan untuk membandingkan susunan gen atau genom antar organisme,
dalam percobaan ini adalah bakteri yang belum teridentifikasi. Informasi yang
tersedia merupakan sekuens nukleotida gen hasil sekuensing DNA dari suatu
sampel bakteri.
Pada percobaan ini, hubungan kekerabatan yang ditentukan merupakan
bakteri yang belum diketahui jenisnya, terhadap spesies atau strain bakteri
lainnya. Tujuan dari penulisan artikel ini adalah menganalisis hubungan
kekerabatan sampel bakteri yang belum teridentifikasi berdasarkan sekuens
genetiknya, dengan menggunakan pendekatan filogenetik molekuler. Dengan
demikian, identitas sampel bakteri tersebut dapat diketahui melalui hubungan
kekerabatannya. Identifikasi beserta karakterisasi dan klasifikasi bakteri
sangat fundamental terhadap banyak bidang, seperti kesehatan publik,
diagnosis klinis, monitoring lingkungan, keamanan pangan, identifikasi agen
biologis yang membahayakan, dan berbagai pemanfaatan lainnya dalam
bidang bioteknologi (Emerson et al ., 2008). Dalam mengidentifikasi dan
mencari hubungan kekerabatan bakteri, dilakukan proses penyejajaran sekuens
antar bakteri yang digunakan. Proses tersebut dikenal dengan multiple
sequence alignment , yaitu penyejajaran 3 atau lebih sekuens biologis dengan
panjang yang sama. Sekuens dapat berupa protein atau asam nukleat (EMBL-
EBI, 2016). Data sekuens yang terkumpul diuji kesamaannya untuk melihat
kedekatannya satu sama lain. Hasil penyejajaran sekuens menggunakan
algoritma komputasional dapat digunakan sebagai data untuk membentuk
pohon filogenetik (Emerson et al ., 2008).

Kunci untuk mengerti keragaman mikroba adalah sistem klasifikasi

yangdapat diandalkan. Secara tradisional, bakteri diklasifikasikan terutama
berdasarkan sifat-sifat fenotipik. Akan tetapi hasinya tidak selalu dapat
diandalkan secara filogeni. Metode molekuler terutama klasifikasi dan
identifikasi berbasis filogenetik,menggunakan parameter yang tidak
bergantung pada kondisi pertumbuhan dan media yang digunakan. Pendekatan
yang umum dipakai saat ini adalah analisis sekuen gen16S-rRNA (Case et al.
2007). Ribosomal RNA (r-RNA) merupakan salah satu makromolekul paling
menarik karena molekul ini merupakan kerangka dari ribosom yang sangat
berperan dalam mekanisme translasi. Semua rRNA identik secara fungsional
yakni terlibat dalam produksi protein. Meski demikian, sekuen di bagian-
bagian tertentu terus berevolusi dan mengalami perubahan pada level struktur
primer sambil tetap mempertahankan struktur sekunder dan tersier yang
homologus (Schluenzenet al. 2000).
Molekul rRNA sangat khas karena disusun oleh daerah-daerah
konservasi yang lebih tinggi dan lebih rendah secara evolusioner. Beberapa
segmen RNA berevolusi sangat lambat sehingga filogeni dari taksa yang
berdekatan dapat dikonstruksi kembali. Bagian lain cukup bervariasi sehingga
dapat dipakai untuk menggolongkan spesies ke dalam genus. Banyaknya
posisi pada molekul 16S-rRNA dan 23S-rRNA yang berevolusi secara bebas
menyediakan data untuk menduga hubungan filogenetik sekelompok mikroba.
Alasan praktis pemakaian rRNA adalah ketersediaan bagi umum untuk dapat
mengakses data base. Sifat rRNA yang sangat terkonservasi memungkinkan
untuk mensintesis primer universal untuk proses PCR yang mampu melekat
pada sekuen terkonservasi dari gen rRNA ketiga domain filogentik: Archaea,
Bacteria dan Eukarya. Daerah yang sangat terkonservasi tersebut sering kali
dipakai menjadi situs pelekatan primer dalam rangka mengamplifikasi gen
16S-rRNA secara in vitro dari template yang diisolasi langsung dari
lingkungan (Drancourtet al. 2000).
Didasarkan pada prinsip amplifikasi gen 16S-rRNA dengan teknik PCR
menggunakan DNA templat yang diisolasi dari lingkungan dapat dibuat
pustaka klongen tersebut. Sekuen gen 16S-rRNA selanjutnya dapat digunakan
untuk mendugasifat-sifat organisme yang belum dapat dikulturkan;
mengidentifikasi model untuk kultivasi (dari kerabat dekat); sintetis pelacak
oligonukleotida untuk tujuan identifikasi, pemisahan morfologi, fisik, deteksi
 pertumbuhan spesifik dalam kultur campuran, memantau distribusinya di alam
dan mengevaluasi laju pertumbuhan relativein situ; dan survey keragaman
hayati dengan cepat dan komprehensif. Karena kemudahan dan kecepatannya,
saat ini teknik PCR digunakan secara luas sebagai metode pilihan untuk
mengamplifikasi fragmen DNA spesifik. Terdapat bebera paprimer universal
yang umum digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S-rRNA bakteri,
diantaranya 23f dan 24f serta 1392r dan 1492r (penomoran primer mengikuti
konsensus sekuen 16S-rRNA E. Coli). Marchesi et al. (2006) mendesain dan
mengevaluasi primer 63f dan 1387r untuk amplifikasi gen 16S-rRNA dari
domain bakteri. Pasangan primer ini mampu mengamplifikasi gen 16S-rRNA
dengan ukuran sekitar 1300 pasang basa. Kedua primer ini berhasil
mengamplifikasi gen 16S-rRNA dari spesies yang secara teoritis menunjukkan
derajat Mismatch pada ujung 5’ lebih tinggi apabila dibandingkan dengan
pasangan 27F-1392R. Keberhasilan tersebut juga menunjukkan konsistensi
untuk mengamplifikasi gen 16S-rRNA dari templat DNA yang diisolasi dari
organisme yang tergolong dalam Coryneform, Micrococcus (Grampositif,
High G+C).

C. Skema Kerja
1. Offline
a. Dibuka aplikasi PHYDIT
b. Diklik file lalu new
c. Akan muncul kontak informasi klik OK
d. Pilih data > import > GDE (NT repleace)
e. Akan muncul kotak open, lalu kemudian cari file dengan format .gde
lalu klik open
f. Pilih analysis, sim table, generating similarity table
g. Selanjutnya klik OK, lalu OK lagi
h. Hasilnya akan muncul dalam wordpad
i. Dicopy tanda panah sampai kebawah
j. Dipaste di excel untuk memudahkan analisis
k. Akan muncul matriks terdiri atas dua bagian, segitiga kanan atas berisi
jumlah nukleotida yang berbeda yang di bandingkan , sedangkan
segitiga kiri bawah berisi data similaritas nukleotida.

2. Online
a. Dibuka MAFFT version 7
b. Diklik aligment
c. Dipilih choose file
d. Dipilih format notepad dimana sekuen-sekuen yang akan kita analisis
berbeda
 e. Diklik open dan diklik submit
f. Selanjutnya akan muncul pilihan, lalu pilih Phylogenetik tree,
kemudian pilih Go dibawah kata bosstrep
g. Dipilih view tree on phylo.io
h. Selanjutnya akan muncul pohon filogenetik

D. Prosedur Kerja
1. Offline

Gambar 1. Open Clustal X > pilih aligment> output format options> klik
Clustal, GDE dan PHYLIP format > OK

Gambar 2. Buka file > load sequences > pilih format fasta noteped > open
Gambar 3. Pilih aligment > do complete aligment > piloh OK

Gambar 4. Clustal X di close

Gambar 5. Copy format .phy > masuk ke file program phylip, pilih exe >
pastekan format .phy > rename menjadi infile

Gambar 6. Masih pada folder yang sama klik dnadist > ketik Y, enter
 Gambar 7. File infile dihapus > file outfile di rename menjadi infile > klik
neighbor > klik Y, enter

Gambar 8. Akan muncul file outree yang dapat dilihat dengan aplikasi
Treeview

Gambar 9. Hasil pohon filogenetik offline

2. Online
 Gambar 1. Dibuka aplikasi PHYDIT

Gambar 2. Diklik file lalu New

Gambar 3. Akan muncul kontak informasi klik OK

 Gambar 4. Pilih Data> Import> GDE (NT replace)

Gambar 5. Cari file dengan format .gde lalu klik open

Gambar 6. Klik OK
Gambar 7. Pilih Analysis > Sim Table; Generating Similarity Table> lalu
klik OK

gambar 8. Dicopy dari tanda panah sampai kebawah, lalu di paste di excel
 Gambar 11. Dibuka MAFFT version 7 pada google,

Gambar 12. Klik Aligment

Gambar 13. Pilih choose file > pilih format noteped > klik open > klik
submit
 Gambar 14. Pilih phylogenetic tree > pilih Go dibawah kata Bosstrap

Gambar 15. Pilih view tree on phylo.io

Gambar 16. Pohon filogenetik

E. Hasil Pengamatan
1. Tabel nama-nama spesies
Tebel 1. Nama-nama spesies

No. Nama Spesies

 1. Francisella tularensis

2. Rickettsia

3. Clostridium ramosum

4. Enterococcus dispar

5. Micrococcus luteus

6. Lactobacillus senioris

7. Nitrobacter winogradskyi

8. Leuconostoc sp

9. Lactobacillus sp

10. Brevibacillus brevis

2. Pohon Filogenetik
a. Hasil pohon filogenetik online

b. Hasil pohon filogenetik offline

 3. Matriks Similaritas

F. Pembahasan
1. Klasifikasi filogenetik
Klasifikasi molekular filogenetik merupakan klasifikasi yang
disusun dengan mempertimbangkan jalur evolusi setiap organisme yang
dikaji. Hal ini berbeda dengan klasifikasi fenetik yang hanya melihat
 hubungan antar organisme berdasarkan karakter yang ada pada saat ini.
Dalam prosesnya, klasifikas molekular filogenetik menggunakan data
berupa urutan (sequence) nukleotida pada DNA atau asam amino pada
protein. Sequence nukleotida yang digunakan dalam klasifikas molekular
filogenetik harus merupakan sequence yang diwariskan langsung oleh
nenek moyang (homolog) serta memiliki kesamaan sejarah evolusi.
Sebuah sequence dapat disebut sebagai marker molekular apabila
memenuhi persyaratan berupa: terdistribusi pada seluruh organisme,
memiliki kesetaraan fungsi pada seluruh organisme, dan memegang
peranan vital bagi kehidupan organisme. Hal ini menjadikan marker
molekular merupakan sequence yang tepat untuk digunakan dalam studi
klasifikasi filogenetik. Hal ini sesuai dengan teori dari Dowel (2008), yang
menyatakan bahwa filogenetik molekuler merupakan teknik yang
mengkombinasikan metode molekuler dan statistik dalam menentukan
hubungan kekerabatan secara evolusi antar organisme atau gen
menggunakan struktur dan fungsi molekul beserta informasi perubahannya
terhadap waktu. Dengan banyaknya data genom yang dipublikasikan, hal
ini membuat filogenetik molekuler terus berkembang dan memberikan
banyak aplikasi. Tujuan utama analisis filogenetik molekuler adalah
menganalisis adanya proses evolusi dan menyajikannya dalam bentuk
pohon filogenetik yang secara grafis menunjukkan kekerabatan antar
spesies atau gen terhadap waktu.
2. Gen 16rRNA
Gen 16S rRNA merupakan salah satu contoh marker molekular
karena terdapat pada organisme baik yang berada pada domain Bacteria,
Archaea, serta Eukarya. Saat ini, informasi mengenai sequence gen 16S
rRNA sudah sangat banyak tersedia pada database internasional dan juga
sudah dijadikan standar penetapan suatu spesies baru dalam studi
taksonomi. Pada praktikum ini kita akan mencoba mengklasifikasikan
sejumlah bakteri dengan cara merekonstruksi pohon filogenetik
berdasarkan sequence gen 16S RNA yang dimiliki. Uraian tersebut sesuai
dengan teori dari Caseet (2007) dan Schluenzenet (2005), yang
menyatakan bahwa secara tradisional, bakteri diklasifikasikan terutama
berdasarkan sifat-sifat fenotipik. Akan tetapi hasinya tidak selalu dapat
diandalkan secara filogeni. Metode molekuler terutama klasifikasi dan
identifikasi berbasis filogenetik,menggunakan parameter yang tidak
bergantung pada kondisi pertumbuhan dan media yang digunakan.
Pendekatan yang umum dipakai saat ini adalah analisis sekuen gen 16S-
rRNA. Ribosomal RNA (r-RNA) merupakan salah satu makro molekul
paling menarik karena molekul ini merupakan kerangka dari ribosom yang
sangat berperan dalam mekanisme translasi. Semua rRNA identik secara
fungsional yakni terlibat dalam produksi protein. Meski demikian, sekuen
di bagian-bagian tertentu terus berevolusi dan mengalami perubahan pada
 level struktur primer sambil tetap mempertahankan struktur sekunder dan
tersier yang homologus.
3. Perbandingan dua pohon filogenetik
Persamaan pohon filogenetik secara offline dan online adalah
sama-sama mengurutkan nama bakteri dengan genus yang sama, memiliki
karakter yang lebih mirip, dan memiliki kekerabatan yang erat. Sehingga
digambarkan dalam galur yang berdekatan. Sedangkan perbedaan dari
pohon filogenetik online dan pohon filogenetik offine adalah mengurutkan
nama spesies bakteri yang tidak memiliki kesamaan karakter , sehingga
galur dari kedua spesies berjauhan.
4. Pohon filogenetik offline
 Perbedaan nukleotida antara Francisella tularensis dengan Rickettsia
26 dari total 1294 nukleotida dengan nilai similaritas 97,99%.
 Perbedaan nukleotida Rickettsia dengan Nitrobacter winogradskyi 82
dari total 1460 nukleotida dengan nilai similaritas 95,83%.
 Perbedaan nukleotida Nitrobacter winogradskyi dengan Lactobacillus
sp 76 dari total 1451 nukleotida dengan nilai similaritas 94,59%.
 Perbedaan nukleotida Lactobacillus sp dengan Enterococcus dispar
101 dari total 1491 dengan nilai similaritas 94,61%.
 Perbedaan nukleotida Enterococcus dispar dengan Lactobacillus
senioris 76 dari total 1460 dengan nilai similaritas 92,86.
 Perbedaan nukleotida Lactobacillus senioris dengan Lauconostoc Sp
73 dari total 1390 dengan nilai similaritas 99,21%.
 Perbedaan nukleotida Lauconostoc Sp dengan Clostridium ramosum
105 dari total 1454 dengan nilai similaritas 95,12%
 Perbedaan nukleotida Clostridium ramosum dengan Micrococcus
luteus 82 dari total 1460 dengan nilai similaritas 91,81%.
 Perbedaan nukleotida Micrococcus luteus dengan Brevibacillus brevis
83 dari total 1429 dengan nilai similaritas 94,51%.

G. Kesimpulan
1. Hasil sekuensi dari praktikum ini adalah perbedaan nukleotida antara
Francisella tularensis dengan Rickettsia 26 dari total 1294 nukleotida
dengan nilai similaritas 97,99%, dan perbedaan nukleotida Rickettsia
dengan Nitrobacter winogradskyi 82 dari total 1460 nukleotida dengan
nilai similaritas 95,83%.
 2. Pembuatan pohon filogenetik terdiri dari cara yaitu online dan offline.
Pada cara online menggunakan MAFFT version 7, sedangkan cara offline
menggunakan aplikasi PHYDIT.

Daftar Pustaka

Baum, David. 2008. Reading a Phylogenetic Tree: The Meaning of Monophyletic

Group. Nature Education 1 (1): 190.
Campbell, Jane B. Reece & Lawrence G. Mitchell. 2008. Biologi, jilid 3. Edisi ke-
8. Erlangga: Jakarta.
Dharmayanti, N.L.P. Indi. 2011. Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi
Organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi. Wartazoa 21 (1): 1-10.
Dowell, Karen. 2008. Molecular Phylogenetics: An Introduction to
Computational Methods and Tools for Analyzing Evolutionary
Relationships. Orono: University of Maine.
EMBL-EBI. 2016. Multiple Sequence Alignment.” [online]. Tersedia:
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/. Diakses 9 Agustus 2018.
Emerson, David, Liane Agulto, Henry Liu, dan Liping Liu. 2008. Identifying and
Characterizing Bacteria in an Era of Genomics and Proteomics.
BioScience 58 (10): 925-936.
Priest, F & B. Austin. 2007. Modern Bacterial Taxouong Second Edition.
Champman dan Hall.London.
Yang, Ziheng dan Bruce Rannala. 2012. Molecular Phylogenetics: Principles and
Practice. Nature Reviews Genetics 13: 303-314.