Dna rekombinan
DNA rekombinan atau rDNA adalah suatu bentuk DNA buatan yang dibuat dengan
cara menggabungkan atau merekombinasi dua atau lebih untaian benang DNA yang dalam
keadaan normal tidak berpasangan atau terjadi bersama.
Pada bahasan biologi molekuler, modifikasi genetik dilakukan dengan memasukkan
DNA yang relevan ke dalam DNA organisme yang hidup misalnya pada plasmid bakteri,
untuk menyandikan suatu sifat khusus tertentu seperti antibiotik dan sifat lain.
Contoh: insulin telah digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Tanaman
kapas-bt telah mengandung gen penyandi toksin yang berasal dari bakteri Bacillus
turingiensis (Bt). Toksin tersebut dapat membunuh hama kapas sehingga kapas-bt tersebut
tahan terhadap serangan hama.
Apakah dasar Teknologi DNA rekombinan ?
Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat pada bakteri.
Hasil Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan bahwa bakteri mempunyai
mekanisme seksual. Mekanisme seksual pada bakteri ini menyebabkan terbentuknya
kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. Mekanisme seksual pada
bakteri ini merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Jadi
mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak
atau zuriat).
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu
konjugasi, transformasi, dan transduksi.
-Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri
lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel.
-Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya.
Ingat: Griffith (1928), Avery dkk (1944)
-Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui
perantaraan fage.
DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat ber-integrasi dengan DNA atau
kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan.
2. ENZIM RETRISTIK
Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang memotong molekul DNA.[1]
Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa.[1] Setiap enzim
mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang
basa.
Pada akhir 1960-an, ilmuwan Stewart Linn dan Werner Arber mengisolasi dua contoh
enzim yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteriofag yang menyerang E.
coli.[3] Salah satu enzim bekerja memetilasi DNA, sedangkan enzim yang satunya bekerja
memotong DNA yang tidak termetilasi pada beberapa lokasi di sepanjang molekul DNA. [3] Enzim
yang pertama disebut metilase (methylase), sedangkan enzim yang satunya
disebut nuklease restriksi (restriction nuclease).[3] Kemudian pada tahun 1968, H.O. Smith, K.W.
Wilcox, dan T.J. Kelley, yang bekerja di Johns Hopkins University, mengisolasi dan
mengkarakterisasi enzim nuklease restriksi pertama.[3] Enzim ini berasal dari bakteri Haemophilus
influenzae, dan diberi nama HindII.[3] Enzim ini selalu memotong molekul DNA pada sekuen
spesifik dengan panjang situs pengenalan enam pasang basa. [3]
bersifat palindromik (palindromic) yang berarti sekuen pengenalan sama jika dibaca dari 5’ 3’
baik utas atas maupun utas bawah.[4] Contohnya adalah HindIII dengan situs pengenalan 5’-
AAGCTT-3’ (utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah).[4]
Enzim restriksi yang berbeda, dapat mempunyai situs pengenalan yang sama, contohnya: SacI
dan SstI.[5]Ezim yang mempunyai situs pengenalan yang sama disebut dengan
istilah isoschizomers.[5] Dalam beberapa kasus, isoschizomers juga memotong DNA pada tempat
yang sama, tetapi beberapa tidak demikian.[5]
Situs pengenalan pada enzim restriksi dapat pasti atau ambigu.[5] Seperti contohnya pada BamHI,
enzim ini sudah pasti memotong pada sekuen GGATCC. [5] Sementara itu, situs pengenalan HinfI
adalah GANTC.[5] N dalam situs pemotongan HinfI berarti dapat diganti oleh basa apa saja, inilah
yang dimaksud dengan situs ambigu[5]. Contoh lainnya situs ambigu adalah XhoII.[5] Enzim ini
mempunyai situs pemotongan PuGATCPy.[5] Pu merupakan singkatan dari purin (basa A atau G),
sedangkan Py merupakan singkatan dari pirimidin (pyrimidine) (basa T atau C).[5] Jadi XhoII dapat
mengenali dan memotong sekuen AGATCT, AGATCC, GGATCT dan GGATCC. [5]
Situs pengenalan satu enzim, dapat mengandung situs pengenalan enzim lainnya [5] Situs
pengenalan BamHI mengandung situs pengenalan Sau3AI. [5] Oleh karena itu, semua sekuen
pemotongan BamHI akan dipotong oleh Sau3AI, tetapi tidak sebaliknya. [5]
Panjang dari sekuen pengenalan memengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA dalam
ukuran tertentu.[6] Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini diperkirakan akan
memotong setiap 256 nukleotida.[6] Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan setiap
basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul
1 dari 4 basa).[6] Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya
menjadi: (1/4)6 = 1/4096.[6] Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan, pada kenyataannya belum
tentu demikian.[6] Beberapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih jarang ditemui dalam suatu
organisme.[6] Seperti pada mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui sehingga enzim HpaII yang
mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan lebih jarang memotong pada DNA mamalia. [6]
Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan banyak
potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan dihasilkan
potongan DNA yang lebih sedikit.[6] Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek
maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika.[6]
Beberapa enzim sering yang digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga berdasarkan
perkiraan pemotongan:[6]
6-cutters[sunting | sunting sumber]
Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan yang spesifik pada 6
nukleotida.[6] Ezim ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim ini
lumayan sering memotong satu atau dua situs pada plasmid, tetapi jarang memotong bagian
penting seperti titik asal replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin.[6] Contoh enzim
6-cutters adalah HindIII (A AGCTT) yang memotong genome bakteriofage lambda (48 kbp)
pada 7 situs.[6]
8-cutters
Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida; cocok digunakan untuk
membentuk kromosom menjadi potongan-potongan yang spesifik dalam ukuran yang
besar.[6] Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters) memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20
bagian, sedangkan BamHI (enzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian.[6] Jika langsung
menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak. [6] Untuk itu
digunakan enzim 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan enzim 6-
cutters.[6]
4-cutters
Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan pemotongan pada beberapa situs
yang potensial.[6] Contohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada
potongan tersebut terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial digestion)
menggunakan enzim 4-cutters.[6]
3. DNA LOGASE
DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung
5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick.[1] Nick pada DNA dapat terjadi pada
saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan.[1] Secara biologis, DNA ligase diperlukan untuk
menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA
yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA. [2] Oleh karena pentingnya
peranan DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA
ligase.[3] Dengan diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi
dan sel akan mati.[3] DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam sel,
maupun di luar sel.[4] Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan enzim restriksi telah
membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA rekombinan. [4] Enzim restriksi diibaratkan
seperti gunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA di tempat yang
spesifik.[4] Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang menyambung DNA yang telah
terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional.[4]
DNA Ligase
DNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan,
yaitu NAD+ atau ATP.[1] DNA ligase NAD+-dependent ditemukan hanya di bakteri.[1] Sementara itu,
DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria, archaea,
[1]
dan virus. Walaupun kedua jenis enzim ini memerlukan kofaktor yang berbeda, keduanya
memiliki mekanisme katalitik yang sama.[2] DNA ligase ATP-dependent yang umum adalah T4
DNA ligase dan T7 DNA ligase.[2]
T4 DNA Ligase[sunting | sunting sumber]
T4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage.[5] Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang
menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul.[5] Untuk meligasi fragmen DNA yang
memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar. [5] Proses ligasi DNA T4
memerlukan larutan penyangga yang mengandung ATP dengan konsentrasi 0.25-1 mM.[5] Proses
ini dapat berlangsung pada kisaran suhu yang luas, namun untuk beberapa kasus, proses ligasi
dilakukan pada suhu tertentu.[5] Seperti pada saat menginginkan efisiensi yang tinggi dalam ligasi
(contohnya membuat pustaka genom) suhu yang disarankan adalah 16 °C.[5] Sementara itu, jika
ligasi bertujuan untuk subcloning, ligasi dapat dilakukan pada suhu 4 °C semalaman, atau pada
suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam.[5]
T7 DNA Ligase[sunting | sunting sumber]
T7 DNA ligase merupakan DNA ligase dengan ukuran terkecil, yaitu sebesar 41 kDa.[2] DNA
ligase ini berasal dari bakteriofage T7, mempunyai struktur yang terdiri dari dua domain dengan
sisi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain yang lebih besar.[2]
Mekanisme DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP.[1]Peristiwa ini
menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup α-amino
residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika kofaktor berupa
ATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor berupa NAD +.[1] Kemudian sebagian
AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA.
Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick
dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate.[1]
4. Vektor kloning
Vektor kloning adalah agen pembawa fragmen DNA masuk ke dalam sel makhluk hidup yang
berfungsi untuk memperbanyak fragmen DNA.[1] Beberapa vektor kloning yang umum digunakan
adalah plasmid, vektor lamda, virus, kromosom bakteri buatan, kromosom khamir buatan,
dan cosmid.[2] Suatu vektor kloning harus dapat disambungkan atau menyatu dengan fragmen
DNA yang ingin ditransfer kemudian dapat dimasukkan ke dalam sel. [3] Di dalam sel tersebut,
fragmen DNA akan diperbanyak jumlahnya.[3] Untuk memilih vektor kloning yang cocok
dalam penelitian, beberapa hal yang harus dipertimbangkan adalah ukuran fragmen DNA yang
akan ditransfer, jumlah salinan, inkompatibilitas (ketidaksesuaian), marka pemilihan (selectable
marker) untuk seleksi, situs kloning, dan fungsi khusus dari suatu vektor
5. Pelacak
DNA probe adalah suatu fragmen DNA atau RNA atau protein pelacak target gen. DNA probe
yang telah dilabel akan berkomplementasi dengan target melalui hibridisasi sehingga dapat
mendeteksi keberadaan gen tertentu. Terdapat dua macam probe,
yaitu homologus dan heterologus. Homologus adalah probe yang diperoleh dari DNA dengan
sumber yang sama dengan DNA yang akan dilacak sehingga ikatan komplemen probe dengan
DNA target cenderung lebih kuat dan presisi. Sedangkan heterologus adalah probe diperoleh dari
sumber organisme yang berbeda atau dibuat secara sintetik sehingga ikatannya kurang presisi
dengan gen target..[1]
label PCR
translasi nik
sintesis oligoprimer secara acak
pelabelan ujung
Senyawa untuk melabel probe dapat berupa senyawa radioisotop atau non-radioisotop. Pelabelan
menggunakan radioisotop yang banyak digunakan yaitu fosfat radioaktif atau 32P. Proses
pelabelan dengan menggunakan 32P dari ATP terlabel radioaktif dilakukan dengan menghilangkan
5’ fosfat dari oligonukleotida menggunakan enzim alkalin fosfatase dan menggantikannya dengan
fosfat terlabel radioaktif menggunakan polinukleotida nuklease. [2] Sedangkan contoh senyawa
non-radioisotop untuk melabel adalah biotin yang memiliki afinitas sangat tinggi
terhadap avidin dan strepavidin.[3] Biotin adalah salah satu anggota kelompok vitamin B kompleks
yang merupakan mikronutrien esensial yang larut dalam air.[4] Probe yang terlabel biotin
menghasilkan resolusi hibridisasi yang tinggi, menurunkan interferensi latar belakang dan stabil
pada suhu -20 °C untuk penyimpanan selama setahun.
6. Proses kloning
kloning merupakan suatu kegiatan memproduksi atau menggandakan sejumlah
individu, hingga hasilnya dilihat secara genetic sama persis berasal dari induk yang sama,
mempunyai susunan yang sama.
Pada setiap bagian Klon tersebut memiliki berbagai susunan dan juga jumlah gen
yang sama serta mempunyai kemungkinan yang besar fenotipnya pun sama. Klon
umumnya di gunakan pada 2 Pengertian di antaranya yaitu:
Klon Sel
yaitu sekelompok sel yang identik dari berbagai macam sifat genetiknya, yang mana
kesemuanya berasal dari satu sel.
Klon Gen
biasa di sebut juga molekuler yang merupakan sekelompok salinan dari Gen yang
mempunyai sifat identiknya direplikasi yakni dari satu gen yang di masukan pada sel inang
Konsep dari cloning berdasarkan dari prinsip bahwasanya makhluk hidup memiliki
kemampuan totipotensi, Maka pada setiap sel memiliki kemampuan menjadi suatu individu.
Jenis – jenis Kloning
Kloning DNA rekombinan
Kloning Terapeutik
Kloning Reproduktif
-Yang mana suatu sel pertama yang nantinya akan tumbuh dan menjadi berbagai sel
tubuh. Sel ini di ambil dari manusia yang akan di Kloning
-Sel stem di dapatkan dengan mengambil inti sel yang mempunyai kandungan berupa
Informasi genetic lalu kemudian di pisahkan dari sel.
2. Menyiapkan Sel Telur
-Merupakan suatu sel yang di ambil secara sukarelawan dari perempuan lalu kemudian inti
selnya di pisahkan
Inti sel dari sel stem di implantasikan ke sel telur
-Sel telur di rangsang supaya melakukan pembelahan dan pertumbuhan. Setelah
membelah di hari kedua menjadi sel embrio.
-Sel embrio yang melakukan pembelahan dinamakan dengan blastosis lalu melakukan
pemisahan diri di hari kelima dan siap di di implantasikan ke dalam rahim.
-Embrio akan berkembang dan tumbuh pada rahim serta menjadi bayi dengan kode genetic
yang sama persis dengan sel stem si donor.
Hasil dari pengertian dan proses Kloning yang di uraikan di atas akan menghasilkan
sebuah individu baru serta mempunyai sifat genetic yang sama
Terdapat beberapa dasar yang harus di kuasai untuk melakukan Kloning dengan
sederhana di antaranya yaitu :
Eugenia positif.
Eugenika negatif
Euthenika (euthenics)
Eugenia positif.
Cara ini menghasilkan perbaikan melalui pembiakan yang selektif, misalnya menghasilkan
berbagai individu yang intelegen dengan cara memakai sperma manusia yang genius.
Eugenika negatif
Cara yang kedua ini di lakukan guna mencegah Gen yang buruk atau juga kurang baik
masuk dalam kumpulan gen. Cara ini bisa dilakukan dengan skrining orang tua dan
memberitahukan semua hal yang mengenai gen yang buruk yang mungkin dibawanya. Hal
ini juga di lakukan dengan amniosentesis
Euthenika (euthenics)
Cara yang ketiga ini yaitu dengan cara merubah lingkungan hingga setiap individu dengan
kekurangan genetic mampu berkembang dengan relative Normal
Artikel Lainya :