Praktikum

kali

ini

bertujuan

untuk

melakukan

pemetaan

DNA

plasmid. Pemetaan plasmid merupakan penentuan posisi relatif dari gen-gen pada sebuah molekul DNA (kromosom atau plasmid) dan dari jarak antara molekul DNA tersebut baik dalam unit-unit ikatan atau dalam unit-unit fisik. Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya. Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis. Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung tumpul atau Blunt end dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau sticky end. Dengan memanfaatkan kerja enzim kita dapat membuat peta restriksi dari suatu molekul DNA. Pertama menyiapkan sebanyak 5-10 g DNA plasmid yang akan dipotong, larutan penyangga 2 l, 1 l enzim restriksi dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 l yang nantinnya akan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf. Setelah semua bahan disiapkan. Bahan yang pertama kali dimasukkan adalah dH2O sebanyak 6 l. Tujuan penambahan dH2O ini adalah untuk mendapatkan volume larutan 20 l. Selain itu juga digunakan untuk mempermudah pencampuran bahan-bahan yang lain. Lalu ditambahkan dengan buffer tango 2 l. Tujuan penambahan buffer ini untuk menjaga ph agar tetap stabil karena praktikum kali ini berurusan dengan DNA, dimana ph tidak akan pernah stabil. Setelah itu, ditambahkan dengan PET Duet

sebannyak 8 l. PET Duet ini berperan sebagai DNA plasmid yang nantinya akan dipotong oleh enzim restriksi disini adalah. Kemudian ditambahkan dengan enzim BamHI dan XhoI sebanyak 2 l. Penambahan kedua enzim ini bertujuan sebagai enzim pemotong, yang nantinya akan memotong Pet Duet yang sudah dimasukkan sebelumnya. Enzim BamHI ini mengenali urutan GGATCC palindrome yaitu urutan basa pasangan sekuennya sama, dan akan memotong hanya pada basa G no 2 dari tepi masing-masing strand. Sedangkan enzim XhoI mengenali urutan basa CTCGAG palindrome dan akan memotong pada basa ujung G dan C. Penggunaan dua enzim restriksi dikarenakan masing-masing enzim akan memotong molekul DNA di posisi yang berbeda dan nantinya akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu enzim restriksi yang berbeda. Kemudian di inkubasi selama kurang lebih selama 1 jam. Setelah diinkubasi kemudian dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzim BamHI dan XhoI yang ditambahkan telah memotong DNA. Setelah elektroforesis yang dilakukan didapatkan hasil bahwa panjang plasmid pET DUET yang digunakan sudah berubah, dari yang berukuran 5420 bp, sekarang menjadi 4960 bp. Hasil pengukuran didapatkan dari pita yang terbentuk dari sampel DNA plasmid pET duet yang dielektroforesis dibandingkan terhadap marker. pengukuran dilakukan dengan membandingkan hasil digesti tunggal dan digesti ganda agar memungkinkan pemetaan di banyak tempat restriksi. Digesti ganda yaitu pemotongan DNA dengan menggunakan 2 enzim restriksi secara bersamaan, sedangkan digesti tunggal adalah marker. Dari Hasil pengukuran menunjukkan bahwa DNA telah terpotong karena hasil sesuai dengan peta pET DUET yang menyebutkan BamHI memotong pada 106 bp dan XhoI memotong pada 354 bp. Dengan ukuran DNA plasmid sebesar 5420 bp, apabila dipotong dengan enzim BamH I dan XHO I (106 bp + 354 bp = 459 bp), maka sisi terestriksi akan berkurang sebanyak 459 bp dan ukuran DNA plasmid menjadi 4960 bp.

Setelah dipastikan DNA telah terpotong, aktivitas pemotongan dari enzim restriksi BamHI dan XhoI dihentikan dengan cara dipanaskan larutan DNA pada suhu 65-70oC. Pemanasan dilakukan karena enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil pada suhu tinggi, sehingga aktivitas enzim akan seketika berhenti. Digunakan suhu 65-70oC karena pada suhu yang lebih tinggi dapat menyebabkan rusaknya DNA. Selanjutnya dilakukan elektroforesis kembali, fungsinya untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya yang kemudian dapat dipastikan pemotongan plasmid berjalan dengan benar, karena restriksi plasmid sendiri merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu sesuai yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik. Di dalam bioteknologi terdapat dua kategori enzim yang berperan dalam proses rekombinasi DNA, yaitu enzim yang berperan dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA rekombinan (dimana dua molekul DNA dikombinasikan). DNA spesifik atau gen diisolasi atau diambil dari DNA dengan memotong sugar-phosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang berbeda dicampur dan dikombinasi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim yaitu enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai gunting untuk memotong DNA pada situs spesifik dan DNA ligase yang berperan sebagai lem yang merekatkan dua molekul DNA di dalam tabung reaksi. Restriksi endonuklase memotong sugar-phosphat backbone DNA pada kedua utasnya. Restriksi endonuklease mengenali urutan spesifik di dalam molekul DNA. Urutan yang spesifik tersebut pada umumnya terdiri dari 4 sampai 6 pasang basa dan bersifat palindromik (palindrom). Palindrom merupakan daerah yang memiliki urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah yang sama yaitu 5-3. Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempattempat tertentu dari urutan basa tersebut.

Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5 atau 3) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif. Enzim restriksi banyak diisolasi dalam bakteri dimana enzim tersebut memotong atau memisahkan, DNA asing bakteriofaga sebelum DNA bakteriofaga menyerbu ke dalam dinding sel bakteri host untuk memproduksi fage-fage yang baru. Sel bakteri resisten karena DNA mereka dimodifikasi secara kimia, terutama dengan penambahan gugus metil untuk melindungi situs pengenalan dari restriksi endonuklease sehingga mereka tidak dapat dipotong. Enzim restriksi dinamakan berdasarkan organisme dari mana enzim tersebut diisolasi. Enzim restriksi yang digunakan pada praktikum kali ini antara lain BamHI dan XhOI, enzim BamHI diisolasi dari Bacillus amyloliquefaciens strain H, Bam berasal dari huruf pertama nama genus dan dua huruf pertama nama spesies, H adalah tipe strain dan I adalah enzim pertama dari tipe tersebut. Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA secara optimal sedangkan XhOI membutuhkan 2-5 basa tambahan untuk mencapai pemotongan yang optimal sebesar 50-1--%. Enzim BamHI mengenali double strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5GGATCC-3 yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa dua fragmen yang ujungnya sticky ends, BamHI dan bentuk simetris atau blunt ends. Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam prosedur protokol restriksi suatu sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation

bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi. Adapun kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong ikatan fosfodiester pada urutan DNA pada sisi 5 G-G-A-T-C-C 3 dan 3 C-C-T-A-GG 5. Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G), sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh enzim BamHI berupa formasi 5PO4 dan 3OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends. Enzim BamHI bekerja dengan cara melakukan scanning sekuens non-spesifik di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelah itu ketika enzim tersebut menemukan sekuens spesifik berupa 5 G-G-A-T-C-C 3 maka akan berupa konformasinyan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah. Satu unit aktivitas enzim restriksi didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat memotong 1 ug DNA fage optimum pada suhu 37oC. selama 1 jam dalam kondisi buffer yang