BAB 4

METODE REKAYASA GENETIKA DAN MOLEKULER

A. Tujuan Pembelajaran

1. Memahami Metode Rekayasa Genetika dan Molekuler.

2. Mampu Memahami Arus Informasi Genetik dan Struktur dari DNA dan RNA.
3. Mampu Memahami Enzim dan Teknik rekayasa genetik

B. Materi
Modifikasi yang disengaja dari informasi genetik suatu organisme dengan secara langsung mengubah genom asam
nukleatnya disebut rekayasa genetika dan dicapai dengan sekelompok metode yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan.

 DNA
Struktur asam deoksiribonukleat (DNA) menyediakan kode kompleks yang mengkode untuk sintesis protein. DNA
sebagai molekul menunjukkan banyak fitur menarik. Salah satu sifat DNA yang berguna adalah bahwa ia siap menganil, artinya ia
mengubah sifat pengikatannya sebagai respons terhadap pemanasan dan pendinginan. Paparan suhu tepat di bawah titik didih
(90-95"C) menyebabkan DNA menjadi terdenaturasi sementara. Ketika panas memutuskan ikatan hidrogen yang menjaga heliks
ganda tetap bersama, DNA akan terpisah secara longitudinal menjadi dua untai. Setiap untai menampilkan kode nukleotidanya
sehingga DNA dalam bentuk ini dapat diuji atau direplikasi. Ketika pemanasan diikuti dengan pendinginan bertahap, dua untai
DNA tunggal bergabung kembali (renature) oleh ikatan hidrogen di tempat yang saling melengkapi. Annealing adalah fitur
penting dari reaksi berantai polimerase (PCR) dan probe asam nukleat dijelaskan kemudian.
  Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika atau rekombinan DNA merupakan kumpulan teknik-teknik eksperiental yang memungkinkan peneliti
untuk mengisolasi,mengidentifikasi, dan melipatgandakan suatu fragmen dari materi genetika (DNA) dalam bentuk murninya.
Rekayasa genetika merupakan dasar dari bioteknologi yang didalamnya meliputi manipulasi gen, cloning gen, DNA rekombinan,
teknologi modifikasi genetic, dan genetika modern dengan menggunakan prosedur identifikasi, replikasi, modifikasi dan transfer
materi genetic dari sel, jaringan maupun organ. Rekayasa genetika adalah aplikasi ilmu pengetahuan untuk kebutuhan sosial.
Dalam beberapa tahun terakhir, rekayasa berdasarkan genetika bakteri telah mengubah biologi. Fragmen DNA tertentu dapat
diisolasi dan diperkuat, dan gennya dapat diekspresikan pada tingkat tinggi. Spesifisitas nukleotida, yang diperlukan untuk
pembelahan oleh enzim restriksi, memungkinkan fragmen yang mengandung gen atau bagian gen untuk terikat secara kovalen
dengan plasmid (vektor) yang kemudian dapat dimasukkan ke dalam inang bakteri.

Koloni atau klon bakteri yang membawa gen tertentu diidentifikasi melalui hibridisasi DNA atau RNA dengan probe kimia
atau radio kimia. Atau, produk protein yang dikodekan oleh gen dikenali baik oleh aktivitas enzim atau dengan teknik logika
imun. Dengan demikian, teknik rekayasa genetika digunakan untuk mengisolasi hampir semua gen dengan sifat biokimia yang
dapat dikenali.

 Persiapan Fragmen DNA dengan Enzim Restriksi

Salah satu tujuan memperoleh suatu daerah DNA dalam suatu genom adalah untuk melakukan perbanyakan (cloning ).
Untuk memperoleh suatu urutan DNA tersebut maka dilakukan pemotongan genom DNA menadi frgamen-fragmen dengan
menggunakan enzim tertentu yang mampu memotong ikatan fosfodieter pada untaian DNA tersebut yakni berupa enzim
restriksi.

Keragaman genetik bakteri tercermin dalam rentang enzim restriksi yang luar biasa, yang memiliki selektivitas luar biasa
yang memungkinkan mereka mengenali daerah spesifik DNA untuk usia pembelahan. Sekuens DNA yang dikenali oleh enzim
restriksi adalah pra-dominan palindrom (pengulangan sekuens inwerted). GAATTC adalah sekuens palindrom yang khas,
dikenali oleh enzim restriksi ecori yang sering digunakan. Pengulangan terbalik, yang melekat pada komplementaritas pasangan
basa G-C dan A-T, menghasilkan urutan 5' TTC yang direfleksikan sebagai AAG dalam untai 3'.

Kebanyakan enzim restriksi mengenali 4, 6, atau 8 basa urutan; namun, enzim restriksi lainnya mengenali 10, 11, 12, atau
15 urutan basa. Enzim restriksi yang mengenali 8 basa menghasilkan fragmen dengan ukuran tipikal 64.000 bp dan berguna
untuk analisis daerah genetik yang besar. Enzim restriksi yang mengenali lebih dari 10 basa berguna untuk konstruksi peta fisik
dan untuk pengetikan molekuler dengan elektroforesis gel medan-pulsa.

 Pemisahan Fisik Fragmen DNA Berukuran Berbeda

Sebagian besar kesederhanaan yang mendasari teknik rekayasa genetika terletak pada kenyataan bahwa elektroforesis
gel memungkinkan fragmen DNA untuk dipisahkan berdasarkan ukuran. Semakin kecil fragmennya, semakin cepat migrasinya.
Laju migrasi keseluruhan dan kisaran ukuran optimal untuk pemisahan ditentukan oleh sifat kimia gel dan derajat ikatan
silangnya. Gel dengan ikatan silang yang tinggi mengoptimalkan pemisahan fragmen DNA kecil. Pewarna etidium bromida
membentuk warna fluoresen cerah saat berikatan dengan DNA, sehingga sejumlah kecil fragmen DNA yang terpisah dapat difoto
pada gel. Fragmen DNA spesifik dapat dikenali dengan probe yang mengandung sekuens komplementer.

Elektroforesis gel bidang berdenyut memungkinkan pemisahan fragmen DNA yang mengandung hingga 100.000 bp (100
pasangan kilobase, atau kbp). Karakterisasi fragmen besar tersebut memungkinkan konstruksi peta fisik untuk kromosom dari
beberapa spesies bakteri.

 Enzim untuk Dicing, Splicing, dan Membalikkan Asam Nukleat

Endonuklease restriksi: Untaian polinukleotida dari DNA juga dapat dipotong melintang pada posisi yang dipilih dengan
enzim yang disebut endonuklease restriksi. Enzim ini mengenali DNA asing dan mampu mencerna atau menghidrolisis ikatan
DNA. Kehadiran enzim dalam sel bakteri melindungi bakteri terhadap DNA bakteri riofag atau plasmid yang tidak kompatibel.
 Di laboratorium, enzim restriksi endonuklease dapat digunakan untuk membelah DNA pada tempat yang diinginkan dan
merupakan suatu keharusan untuk teknik teknologi DNA rekombinan. Sejauh ini, ratusan restriksi endonuklease telah ditemukan
pada bakteri. Setiap jenis memiliki urutan 4-10 bp yang diketahui sebagai targetnya, sehingga lokasi pemotongan dapat dikontrol
dengan baik. Endonuklease diberi nama dengan menggabungkan huruf pertama genus bakteri, dua huruf pertama spesies, dan
nomor endonuklease. Misalnya, ecori adalah endonuklease pertama yang ditemukan pada Escherichia coli dan hindiii adalah
endonuklease ketiga yang ditemukan pada tipe Haemophilus influenzae.

Polimorfisme panjang fragmen restriksi: Potongan DNA yang dihasilkan oleh endonuklease restriksi disebut fragmen
restriksi. Karena genom anggota spesies yang sama dapat bervariasi dalam pola pemotongan oleh endonuklease spesifik,
perbedaan genetik dapat dideteksi dengan polimorfisme panjang fragmen restriksi (rflps).

Ratusan situs pembelahan yang menghasilkan RFLPS didistribusikan ke seluruh genom. Karena RFLPS berfungsi sebagai jenis
penanda genetik, mereka dapat membantu menemukan lokasi spesifik di sepanjang untai DNA. RFLP dengan demikian berguna
dalam persiapan peta gen dan profil DNA, dan juga dalam analisis hubungan genetik.

 Ligase: Ini adalah enzim yang diperlukan untuk menutup ujung lengket bersama-sama Cl dengan menggabungkan
kembali ikatan fosfat-gula yang dipotong oleh endonuklease, ing Aplikasi utamanya adalah dalam penyambungan akhir
gen menjadi plasmid dan kromosom.

 Reverse transcriptase: Ini adalah enzim, paling dikenal karena perannya dalam replikasi virus AIDS dan retrovirus
lainnya. Enzim DNA ini digunakan oleh ahli genetika sebagai alat yang berharga untuk mengubah RNA kerja menjadi
DNA.

 DNA komplementer: Salinan yang disebut DNA komplementer, atau cdna, dapat dibuat dari messenger, transfer, ribosom,
dan bentuk RNA lainnya. Teknik ini menyediakan sarana yang berharga untuk mensintesis gen eukariotik dari transkrip
mrna. Keuntungannya adalah gen yang disintesis akan bebas dari sekuens intervening (intron) yang dapat mempersulit
pengelolaan gen eukariotik dalam rekayasa genetika. DNA komplementer juga dapat digunakan untuk menganalisis
urutan nukleotida RNA, seperti yang ditemukan di ribosom dan RNA transfer.
  Metode yang Digunakan untuk Mengukur, Mensintesis, dan Mengurutkan DNA

Ukuran relatif asam nukleat biasanya diketahui dengan jumlah pasangan basa atau nukleotida yang dikandungnya.
Misalnya, sekuens palindromik yang dikenali oleh endonuklease biasanya panjangnya 4-10 bp. Gen rata-rata dalam E. Coli adalah
sekitar 1300 bp, atau 1,3 kilobase (kb), dan seluruh genomnya adalah sekitar 4,7 juta pasangan basa (Mb). Virus Epstein-Barr,
penyebab mononukleosis menular, memiliki gen 172 kb. Manusia memiliki sekitar 3,5 miliar pasangan basa (Bbp) yang tersusun
di sepanjang 46 kromosom.

Oligonukleotida adalah potongan DNA atau RNA yang sangat pendek. Panjangnya bervariasi dari 2 hingga 200 bp,
meskipun yang paling umum adalah sekitar 20-30 bp. Mereka dapat diisolasi dari sel atau dibuat khusus oleh penyintesis DNA
yang membatasi panjangnya menjadi sekitar 200 nukleotida.

Probe hibridisasi digunakan secara rutin dalam kloning DNA. Urutan asam amino protein digunakan untuk
menyimpulkan urutan DNA dari mana probe dapat dibangun dan digunakan untuk mendeteksi koloni bakteri yang mengandung
kloning. Gen. Cdna, dikodekan oleh mrna, digunakan untuk mendeteksi gen yang mengkode mrna.

 Jenis Hibridisasi

 Northern blot: Hibridisasi DNA menjadi RNA dikenal sebagai Northern blot, yang memberikan informasi kuantitatif
tentang sintesis RNA.

 Southern blot: Hibridisasi DNA menjadi DNA dikenal sebagai Southern blot. Metode ini berguna untuk mendeteksi
sekuens DNA spesifik pada fragmen restriksi yang dipisahkan pada gel. Bercak ini dapat digunakan untuk mendeteksi
fragmen restriksi yang tumpang tindih.

 Western blot: Ini adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi gen, di mana antibodi digunakan untuk mendeteksi
gen kloning dengan mengikat produk protein mereka.
 Menempelkan fragmen ini memungkinkan untuk mengisolasi daerah mengapit DNA dengan teknik yang dikenal sebagai
berjalan kromosom.

 Pengurutan DNA

Sekuensing DNA menunjukkan struktur gen yang membantu para peneliti untuk mengetahui struktur produk gen.

Point kunci
Sekuensing DNA memiliki banyak aplikasi sebagai berikut:
 Informasi yang diperoleh dengan sekuensing DNA membuatnya mungkinuntuk memahami atau mengubah fungsi gen.
 Analisis uruta DNA menunjukkan daerah pengatur yang mengontrol ekspresi gen dan “titik panas” genetic yang sangat
rentan terhadap mutasi.
 Perbandingan urutan DNA ditunjukkan dengan hubungan evolusioner yang menyediakan kerangka kerja untuk
klasifikasi pasti mikroorganisme termasuk virus.
 Perbandingan urutan DNA memfasilitasi identifikasi daerah yang dilestarikan, yang brguna untuk pengembangan probe
hibridisasi spesifik untuk mendeteksi mikroorganisme termasuk virus dalam sampel klinis.

Teknik Maxam-Gilbert dan metode Sanger (terminasi dideoksi) adalah dua metode yang digunakan secara rutin untuk
penentuan urutan DNA. Teknik Maxam-Gilbert tergantung pada tanggung jawab kimia relatif dari ikatan nukleotida yang
berbeda, sedangkan metode Sanger menyela pemanjangan urutan DNA dengan memasukkan dideoksinukleotida ke dalam
urutan.
  Probe Asam Nukleat

Gambar 4.1 Probe Asam Nukleat

Sumber: Textbook Of Microbilogi And Immonology 2nd Edition, 2012

Probe asam nukleat adalah segmen DNA dan RNA yang diberi label dengan radioisotop atau enzim yang dapat
berhibridisasi menjadi asam nukleat komplementer dengan tingkat spesifisitas yang tinggi. Probe hibridisasi memiliki nilai
praktis, karena dapat mendeteksi urutan nukleotida spesifik dalam sampel yang tidak diketahui. Probe membawa molekul
reporter, seperti label radioaktif, yang merupakan isotop yang memancarkan radiasi, atau label luminescent, yang mengeluarkan
cahaya tampak. Reaksi dapat diungkapkan dengan menempatkan film fotografi dalam kontak dengan reaksi uji. Probe fluoresen
mengandung pewarna yang dapat divisualisasikan dengan sinar ultraviolet. Probe dapat digunakan dalam berbagai prosedur
analitik.

Dua asam nukleat yang berbeda dapat berhibridisasi dengan bersatu di tempat komplementernya. Semua kombinasi yang
berbeda dimungkinkan: DNA untai tunggal dapat bersatu dengan DNA untai tunggal atau RNA lainnya, dan RNA dapat
berhibridisasi dengan RNA lain. Properti ini membentuk dasar pelacak otida oligonukle yang diformulasikan secara khusus yang
disebut probe gen.
Point kunci
Aplikasi Probe DNA
Probe DNA adalah metode nonamplifikasi, mereka hanya mendeteksi DNA dalam spesimen tetapi tanpa amplifikasi yang
sama. Probe DNA memiliki banyak aplikasi sebagai berikut.

 Sejumlah probe DNA telah dikembangkan untuk identifikasi isolat kultur dan untuk berbagai kegunaan dalam
mikrobiologi klinis dengan (a) deteksi langsung mikroba dalam spesimen klinis dan (b) dengan identifikasi organisme
setelah isolasi budaya.
 Beberapa daerah DNA manusia menunjukkan variabilitas substansial dalam distribusi situs restriksi. Variabilitas ini
disebut polimorfisme panjang fragmen restriksi. Probe oligonukleotida yang berhibridisasi dengan fragmen DNA RFLP
dapat digunakan untuk melacak DNA dari sampel kecil ke donor manusianya. Dengan demikian, teknik ini berharga
untuk ilmu forensik.

 Aplikasi RFLP untuk pengobatan mencakup identifikasi daerah genetik yang terkait erat dengan gen manusia dengan
disfungsi yang digabungkan dengan penyakit genetik. Informasi ini. akan menjadi bantuan yang berharga dalam
konseling genetik
  Reaksi Rantai Polimerase

Gambar 1.2 Reaksi Rantai Polimerase

Sumber: https://docplayer.info/amp/61773644-Metode-metode-dalam-biologi-molekuler-isolasi-dna-pcr-kloning-dan-
elisa.html

Pada tahun 1983, Kary Mullis mengembangkan teknik baru yang memungkinkan untuk mensintesis sejumlah besar
fragmen DNA tanpa mengkloningnya. Teknik ini disebut rantai polymerase reaksi (PCR) dan memiliki kepentingan praktis yang
besar dan dampak pada bioteknologi. Dengan teknik ini, sejumlah besar urutan DNA tertentu dapat disiapkan.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah
spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.
Dalam PCR, urutan oligonukleotida yang identik dengan yang mengapit urutan target pertama kali disintesis. Oligonukleotida
sintetik ini biasanya panjangnya sekitar 20 nukleotida dan berfungsi sebagai primer untuk sintesis DNA. Potongan mulai dari
ukuran kurang dari 100 bp hingga beberapa 1000 bp panjangnya dapat diperkuat, dan hanya diperlukan 10-100 pmol primer.
Konsentrasi DNA target bisa serendah 10-15 L

Campuran reaksi untuk PCR mengandung (a) DNA target (b) kelebihan yang sangat besar dari primer yang diinginkan, (c)
polimerase DNA termostabil, dan (d) empat deoksiribonukleosida trifosfat. Hanya DNA polimerase yang dapat berfungsi pada
suhu tinggi yang dapat digunakan dalam teknik PCR. Taq poli merase dari bakteri termofilik Thermus aquaticus dan Vent
polimerase dari Thermococcus litoralis adalah dua enzim populer yang digunakan dalam PCR.

Siklus PCR berlangsung dalam tiga langkah sebagai berikut:

a. DNA target yang mengandung urutan yang akan diamplifikasi didenaturasi dengan panas untuk memisahkan untaian
komplementernya. Biasanya DNA target memiliki panjang antara 100 dan 5000 bp.
b. Suhu diturunkan sehingga primer dapat menyatu dengan DNA di kedua sisi urutan target. Karena primer hadir secara
berlebihan, untaian DNA yang ditargetkan biasanya anil ke primer daripada satu sama lain.
c. DNA polimerase memperluas primer dan mensintesis salinan ukuran sekuens DNA target menggunakan deoksiri
bonukleosida trifosfat.

Pada akhir satu siklus, urutan target pada kedua untai disalin. Ketika siklus tiga langkah diulang, empat helai dari siklus
pertama disalin untuk menghasilkan delapan fragmen. Siklus ketiga menghasilkan 16 produk. Secara teoritis, 20 siklus akan
menghasilkan sekitar satu juta salinan urutan DNA target, dan 30 siklus menghasilkan sekitar satu miliar salinan.

Teknik PCR kini telah otomatis dan dilakukan melalui mesin yang dirancang khusus yang disebut thermocy cler. Saat ini,
mesin thermocycler atau PCR dapat melakukan 25 siklus dan mengamplifikasi DNA 10' kali hanya dalam 57 menit. Selama siklus
 khas, DNA didenaturasi pada 94°C selama 15 detik, kemudian primer dianil dan diperpanjang (langkah 2 dan 3) pada 68°C
selama 60 detik. Teknologi PCR terus berkembang dan mengalami banyak perubahan sebagai berikut:

 Saat ini, RNA dapat digunakan secara efisien dalam prosedur PCR. The DNA polimerase, Thermas rekombinan
thermophilus DNA polimerase, akan mentranskripsi RNA menjadi DNA dan kemudian mengamplifikasi DNA. RNA seluler
dan virus RNA dapat dipelajari bahkan ketika RNA hadir dalam jumlah yang sangat kecil (sedikitnya 100 salinan dapat
ditranskripsi dan diperkuat).
 Juga, PCR dapat mengukur produk DNA tanpa menggunakan isotop. Hal ini memungkinkan seseorang untuk menemukan
jumlah awal DNA target dalam waktu kurang dari satu jam menggunakan peralatan otomatis. PCR kuantitatif cukup
berharga dalam studi virologi dan ekspresi gen.
 Seperti disebutkan sebelumnya, DNA target yang akan diamplifikasi biasanya panjangnya kurang dari sekitar 5000 bp.
Teknik PCR panjang telah dikembangkan yang akan memperkuat sekuens hingga 42 kilo basa. Itu tergantung pada
penggunaan polimerase koreksi kesalahan karena Taq polimerase rawan kesalahan.
 Multiplex PCR adalah modifikasi lain dari PCR di mana dua atau lebih sekuens target dapat ditunjukkan secara simultan
dalam satu spesimen pada waktu yang sama. Metode ini menggunakan dua atau lebih set primer yang dirancang untuk
amplifikasi target yang berbeda. Multipleks sekarang semakin dievaluasi untuk demonstrasi simultan dari dua atau lebih
gen patogen dalam spesimen klinis.
 Real-time PCR adalah perkembangan terbaru. Dinamakan demikian, karena amplikon PCR dapat dideteksi secara real
time. Faktanya, "waktu nyata" mengacu pada deteksi amplikon setelah setiap siklus PCR. Beberapa instrumen komersial
tersedia yang menggabungkan amplifikasi PCR DNA target dengan deteksi amplikon dalam wadah tertutup yang sama.
Format deteksi probe melibatkan pendeteksian fluorofor. Hasilnya semikuantitatif dan dapat diperoleh dalam waktu
yang jauh lebih singkat daripada yang diperlukan untuk melakukan uji PCR konvensional.

Komponen PCR
1. Enzim DNA polymerase
Dalam sejarah, PCR dilakukan dengan menggunaka klenow fragmen DNA polymerase 1 selama reaksi polimerasinya. Enzim ini
tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga harus menambah enzim disetiap siklusnya, dan hanya bisa dipakai
untuk perpanjangan.
2. Primer
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan
diperbanyak. Panjang primer berkisar sekitar 20-30 basa.
3. Reagen lainnya
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen yang lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut
adalah Dntp untuknreaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung Mg C 2.

 Teknologi DNA rekombinan

Dalam teknologi DNA rekombinan, pertama, DNA yang bertanggung jawab untuk fenotipe tertentu diidentifikasi dan
diisolasi. Setelah dimurnikan, gen atau gen tersebut menyatu dengan potongan DNA lain untuk membentuk molekul DNA
rekombinan. Ini dipropagasi (kloning gen) dengan memasukkan ke dalam organisme yang bahkan tidak perlu berada di kerajaan
yang sama dengan donor gen asli.

 Mengkloning Vektor dan Host

Vektor rekombinan yang baik memiliki dua kualitas yang sangat diperlukan: ia harus mampu membawa sebagian besar DNA
donor dan harus siap diterima oleh inang kloning.

a. Vektor kloning
Vektor kloning meliputi:
 Plasmid adalah vektor yang sangat baik karena kecil, berkarakteristik baik, mudah dimanipulasi, dan dapat dipindahkan
ke sel inang yang sesuai melalui transformasi. Plasmid E. coli membawa penanda genetik untuk resistensi terhadap
antibiotik, meskipun dibatasi oleh jumlah DNA asing yang relatif kecil yang dapat diterimanya.
 Bakteriofag juga merupakan vektor yang baik karena memiliki kemampuan alami untuk menyuntikkan DNA ke dalam
inang bakteri melalui transduksi. Fag Charon2 adalah vektor fag yang dimodifikasi yang tidak memiliki sebagian besar
genomnya; karenanya dapat membawa segmen DNA asing yang cukup besar.
  Vektor hibrida telah dikembangkan dengan menyatukan dua vektor yang berbeda. Kosmid adalah contoh vektor hibrida
yang menggabungkan plasmid dan fag dan mampu membawa urutan genom yang relatif besar. Vektor hibrid E. coli-ragi
dapat disisipkan pada host kloning bakteri dan ragi.

b. Mengkloning host

E. coli adalah inang kloning tradisional yang masih digunakan di sebagian besar percobaan. Ini karena bakteri ini adalah
inang rekombinan asli dan protokol yang menggunakannya sudah mapan, relatif mudah, dan dapat diandalkan. Ratusan vektor
kloning khusus telah dikembangkan untuk itu. Kerugian utama dengan E. colt adalah kurangnya fleksibilitas dalam mengekspresikan
gen eukariotik dengan benar.

Ragi Saccharomyces cerevisiae adalah inang alternatif lain yang digunakan untuk proses dan penelitian industri tertentu.
Inang yang eukariotik ini sudah memiliki mekanisme untuk memproses dan memodifikasi produk gen eukariotik. Teknik tertentu
juga dapat menggunakan bakteri yang berbeda (Bacillus subtilis), kultur sel hewan, dan bahkan hewan dan tumbuhan hidup untuk
dijadikan sebagai inang kloning.

 Produk Biologis Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan digunakan oleh perusahaan farmasi untuk memproduksi obat-obatan yang tidak dapat
diproduksi dengan cara lain. Penyakit, seperti diabetes dan dwarfisme, yang disebabkan oleh kekurangan hormon esensial sekarang
sedang diobati dengan mengganti gen hormon yang hilang. Insulin babi dan sapi pernah menjadi satu-satunya bentuk yang tersedia
untuk mengobati diabetes, meskipun produk hewani tersebut digunakan untuk menyebabkan reaksi alergi pada individu tertentu
yang sensitif. Sebaliknya, dwarfisme yang tidak dapat diobati dengan hormon pertumbuhan hewan hanya diobati dengan hormon
pertumbuhan manusia (HGH) yang diperoleh dari hipofisis mayat. Pada suatu waktu, HGH tidak cukup tersedia untuk merawat
ribuan anak yang membutuhkan. Namun, sekarang skenario diubah dengan munculnya HGH rekombinan. Teknologi rekombinan
telah mengubah hasil dari kondisi ini dan banyak kondisi lainnya dengan memungkinkan pembuatan hormon dan enzim penyelamat
kehidupan dalam skala besar yang berasal dari manusia
  Organisme yang Dimodifikasi Secara Genetik

Proses pengenalan gen asing secara artifisial ke dalam organisme disebut transfeksi, dan organ rekombinan yang
dihasilkan dengan cara ini disebut organisme transgenik atau yang dimodifikasi secara genetik.
Gen asing telah dimasukkan ke dalam berbagai mikroba, tumbuhan, dan hewan melalui teknik DNA rekombinan yang
dikembangkan khusus untuk mereka. Organisme "perancang" transgenik tersedia untuk berbagai aplikasi bioteknologi. Karena
mereka adalah bentuk kehidupan yang unik yang tidak akan pernah terjadi, mereka dapat dipatenkan.

 Terapi gen

Terapi gen adalah teknik untuk mengganti gen yang rusak dengan yang normal pada individu dengan penyakit genetik
yang fatal atau sangat melemahkan. Manfaat yang melekat dari terapi ini adalah untuk secara permanen menyembuhkan
disfungsi fisiologis dengan memperbaiki cacat genetic.
Ada dua strategi untuk terapi ini: terapi ex vivo dan terapi in vivo. Dalam terapi ex eine, gen normal dikloning dalam
vektor, seperti retrovirus (misalnya, virus leukemia tikus) atau adenovirus yang menular tetapi relatif kurang berbahaya.
Jaringan yang diambil dari pasien diinkubasi dengan virus yang dimodifikasi secara genetik ini untuk ditransfeksi dengan gen
normal. Sel-sel yang ditransfusikan kemudian dimasukkan kembali ke dalam tubuh pasien melalui transfusi. Sebaliknya, jenis
terapi in vivo tidak memiliki langkah perantara untuk menginkubasi jaringan pasien yang dieksisi. Sebaliknya, DNA telanjang
atau vektor virus langsung dimasukkan ke dalam jaringan pasien.

Percobaan terapi gen pertama pada manusia dimulai pada tahun 1990 oleh para peneliti di National Institutes of Health, AS.
Subjek adalah seorang anak perempuan berusia 4 tahun yang menderita penyakit imunodefisiensi berat akibat kekurangan enzim
adenosin deaminase (ADA). Dia ditransfusikan dengan sel darahnya sendiri yang telah direkayasa untuk mengandung gen ADA
fungsional. Kemudian, anak-anak lain diberi jenis terapi yang sama. Sejauh ini, anak-anak telah menunjukkan peningkatan yang luar
biasa dan terus sehat, tetapi pengobatannya tidak permanen dan harus diulang. Uji coba terkontrol ilmiah yang tepat diperlukan
sebelum induksi sebagai praktik klinis rutin.
 Ada beberapa prinsip yang digunakan untuk menggantikan atau memperbaiki gen yang rusak
1. Insersi gen yang normal pada lokasi yang tidak spesifik di dalam genom untuk menggantikan gen yang tidak berfungsi. Prinsip ini
merupakan pendekatan umum yang paling sering digunakan.
2. Gen yang tidak normal dihilangkan dari genom individu dan digantikan oleh gen yang normal menggunakan cara homologous
recombination.
3. Gen yang tidak normal dapat diperbaiki melalui cara selective reverse mutation.
4. Mengubah regulasi (pengaturan) gen tertentu

 Jenis terapi gen

Terapi gen dibedakan atas 2 jenis yaitu
a) Terapi gen sel somatik (somatic-cell gene therapy) atau gene therapy non hereditable. Pada terapi gen sel somatik, gen
yang normal atau telah dimodifikasi ditransfer ke dalam sel-sel somatik pasien. Terapi gen ini hanya dapat mengatasi
penyakit atau kelainan pada pasien yang bersangkutan. Gen yang telah diperbaiki atau dimodifikasi ini tidak dapat
diturunkan kepada generasi selanjutnya, karena gen yang telah diperbaiki ini hanya ada pada sel-sel somatik saja dan
tidak ada pada sel-sel germinal.
b) Terapi gen sel germinal (Germ line /hereditable gene therapy)
Pada terapi gen sel germinal, gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal akan diperbaiki dengan cara
menginsersikan dan mengintegrasikan gen yang normal atau gen yang telah dimodifikasi kedalam genom sel-sel germinal. Gen
yang telah diinsersikan ini kemudian akan diturunkan ke generasi berikutnya. Terapi gen sel germinal sangat bermanfaat untuk
mengatasi penyakit-penyakit genetik dan penyakit-penyakit yang bersifat herediter. Akan tetapi terapi gen sel germinal hingga
kini masih sulit dilakukan karena alasan tehnis dan etik. Bila gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal ini diperbaiki dan
diturunkan berarti kita telah mengubah genetik
seseorang. Hal inilah yang menjadi kendala untuk melakukan terapi gen sel germinal

 Metoda terapi gen

Metoda terapi gen dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok besar yaitu
 1. transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen normal kedalam sel-sel sasaran pada pasien dengan menggunakan vector
biologi yaitu virus.
2. transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen yang normal
kedalam sel-sel sasaran pada pasien dengan menggunakan cara non virus. Beberapa cara non virus yang dapat digunakan adalah
Naked DNA, Oligonucleotides, lipoplexes dan polyplexes, hibrid methods, dendrimers

 Transfer gen menggunakan vektor biologis

Jenis virus yang banyak digunakan sebagai vektor adalah
A. Retrovirus.
Materi genetik pada virus ini adalah dalam bentuk rna, sebaliknya materi genetik pada sel-sel tubuh sasaran adalah
dalam bentuk dna. Ketika retrovirus menginfeksi sel sasaran (host), selain memasukkan rna-nya, ia juga akan memasukkan
ensim reverse transcriptase dan integrase kedalam sel sasaran tersebut. Rna ini kemudian akan diubah menjadi dna melalui
proses reverse transcription menggunakan ensim reverse transcriptase. Dna kemudian akan ditransfer kedalam inti sel sasaran
dan kemudian akan berintegrasi pada tempat tertentu di genom sel sasaran dengan bantuan ensim integrase. Setelah dna yang
telah diperbaiki ini terintegrasi pada tempat tertentu di genom sel sasaran maka dikatakan bahwa genom sel-sel sasaran (host)
ini telah dimodifikasi
B. Adenovirus
Ketika virus adenovirus meninginfeksi sebuah sel inang, molekul DNA virus tersebut akan dimasukkan kedalam sel inang
tersebut. Materi genetik adenovirus tidak bersatu dengan materi genetic sel inang. Molekul DNA virus terletak bebas dalam inti
sel dan proses transkripsinya berlangsung secara sendiri. Molekul DNA virus tidak ikut berreplikasi ketika sel mengalami
pembelahan sehingga sel-sel inang hasil pembelahan tidak mengandung DNA virus. Akibatnya padaterapi gen menggunakan
vektor adenovirus membutuhkan pemasukkan kembali gen-gen yang sudah dimodifikasi ke dalam populasi sel yang baru.
Sebaliknya keadaan ini akan mencegah terjadinya kanker.

 Transfer gen menggunakan cara non virus

Beberapa metoda non virus yang dapat digunakan adalah
1. Naked DNA
 Metoda ini merupakan metoda transfeksi non virus yang sangat sederhana. Penelitian klinik dengan cara menyuntikan naked
DNA secara intramuskular menunjukkan sebagian hasil yang sukses dan sebagian lagi mengalami kegagalan. Ekspresi gen pada
metoda transfeksi ini sangat rendah dibandingkan dengan cara transfeksi lainnya.
2. Oligonukleotida
Oligonukleotida sintetik digunakan untuk menginaktifkan gengen yang terlibat dalam proses penyakit. Beberapa metoda
yang dapat digunakan antara lain adalah
a. Menggunakan antisense yang spesifik untuk gen sasasaran yang akan mengganggu proses transkripsi gen sasaran yang
rusak.
b. Menggunakan oligonukleotida rantai ganda (double strand oligonucleotide) yang akan mengikat faktorfaktor transkripsi
yang diperlukan untuk regulasi promoter gen sasaran.
3. Lipoplexes and polyplexes
Untuk meningkatkan kwalitas pengangkutan DNA yang baru ke dalam sel, DNA tersebut harus dilindungi dari kerusakan dan
pemasukkannya kedalam sel harus difasilitasi. Untuk memfasilitasi pemasukan gen ke dalam sel dapat digunakan molekul lipid
yang dikenal sebagai lipoplexes dan polyplexes yang dirancang untuk melindungi DNA dari proses degradasi selama proses
transfeksi. Molekul lipid ini digunakan untuk membungkus plasmid yang mengandung DNA dalam bentuk seperti micelle atau
liposome.
4. Metoda Hibrid (Hybrid method)
Untuk meningkatkan efisiensi trnasfer transgen dikembangkan metoda hibrid (campuran) yaitu kombinasi liposome dengan
virus influenza atau HIV yang diinaktifkan.

 Hambatan dalam terapi gen

Ada beberapa faktor yang menghambat efektivitas penggunaan terapi gen dalam mengatasi penyakit-penyakit genetik yaitu
1. Masa hidup alami terapi gen yang pendek (Short-lived nature of gene therapy). Agar terapi gen menjadi efektif , gen yang
dimasukkan kedalam sel-sel target harus dapat berfungsi dan sel-sel yang mengandung gen terapi ini harus dapat hidup lama
dan stabil.
2. Respons Imunologik. Adanya stimulus tertentu yang merangsang timbulnya respons imunologik yang dapat menurunkan
efektivitas terapi gen tentu sangat merugikan. Lebih jauh adanya respon imunologik ini juga akan menyulitkan pengulangan
terapi gen pada pasien.
 3. Masalah dengan virus yang berfungsi sebagai vektor. Beberapa masalah yang harus dipertimbangkan pada penggunaan virus
sebagai kendaraan pembawa gen yang telah diperbaiki adalah toksisitas, reaksi imunologik dan inflamasi, kontrol gen dan
jaringan sasaran. Ketakutan lainnya adalah kemungkinan pulihnya kembali kemampuan virus untuk menyebabkan penyakit
pada manusia
4. Kelainan gen yang multipel. Terapi gen sulit digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit yang disebabkan oleh adanya
kombinasi gen-gen yang mengalami kerusakan, misalnya pada penyakit jantung, tekanan darah tinggi, Alzheimer, artritis dan
diabetes.
5. Potensi untuk timbulnya tumor. Bila DNA diintergrasikan pada tempat yang salah di dalam genom, misalnya pada daerah
tumor suppressor gene, hal ini dapat menyebabkan timbulnya tumor. Hal ini pernah terjadi pada percobaan klinis pada
pasien dengan X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) yang diterapi dengan sel punca darah (Hematopoietic
stem cells yang diinfeksi oleh retrovirus yang mengandung transgen. Tiga dari 20 pasien yang diterapi dengan cara ini
kemudian menderita leukemia.

 Prasyarat terapi gen

Untuk melakukan terapi gen ada persyaratan yang harus dipenuhi yang dikembangkan oleh National Institute of Health
(NIH).
Beberapa prasyarat yang harus dipenuhi agar prosedur terapi gen dapat di izinkan adalah:
1. Gen harus di klon dan diketahui karakteristiknya, sehingga harus tersedia dalam bentuk murni.
2. Harus ada metoda efektif yang digunakan untuk memasukkan trasngen ke dalam jaringan atau sel yang dituju
3. Resiko terapi gen harus dievaluasi secara berhati-hati dan dibuat seminimal mungkin
4. Penyakit tidak dapat diobati dengan cara lainnya.
5. Harus ada data penelitian pendahuluan dengan hewan model atau sel manusia dan hasilnya menunjukkan bahwa usulan
terapi gen tersebut adalah efektif.

C. Rangkuman
1. Rekayasa genetika adalah suatu proses yang mengubah susunan genetik dari suatu organisme dengan menghapus atau
memasukkan DNA.
2. Struktur materi genetik, meliputi gen, kromosom, DNA, RNA, plasmid, episom, dan elemen tranposabel.
3. Teknologi rekayasa genetik dalam bidang farmasi menghasilkan protein, vaksin, dan antibiotik.
4. Dampak negatif tanaman trasgenik yaitu: Menyebabkan erosi plasma nutfah, contoh jagung Bt, dapat menyebabkan kematian larva
spesies kupu-kupu. Menyebabkan pergeseran gen. Menyebabkan pergeseran ekologi.
5. rekayasa genetika adalah bagian dari mutasi adalah benar. Setelah ditemukannya teknik rekayasa genetika, banyak ilmuwan yang
dengan sengaja mendorong terjadinya peristiwa mutasi pada makhluk hidup lainnya. Mutasi yang demikian disebut mutasi buatan.

D. Kontributor
Robiatul Adawiyah (21110022), Amana Marliyana (21110009), dan Haufy Septa Fadillah (21110042)

E. TUGAS

1. Apa yang dimaksud dengan faktor genetik?

2. Apa perbedaan gen DNA dan RNA?
3. Apa yang dimaksud dengan genetic?
4. Apa yang akan terjadi jika rekayasa genetika tidak terkendali?
5. Bagaimana pemanfaatan rekayasa genetika dalam bidang kesehatan?
 F. Glosarium

Amplifikasi : pembesaran, perluasan, atau pengembangan (tentang jumlah, kepentingan,dsb).

Denaturasi : sebuah proses dimana protein atau asam nukleat kehilangan struktur tersier dan struktur sekunder dengan
penerapan beberapa tekanan eksternal atau senyawa, seperti asam kuat atau basa, garam anorganik
terkonsentrasi.
DNA probe : suatu fragmen DNA atau RNA atau protein pelacak target gen.
Eksperiental : suatu set tindakan dan pengamatan, yang dilakukan untuk mengecek atau menyalahkan hipotesis atau mengenali
hubungan sebab akibat antara gejala.
Endonuklease restriksi : enzim yang memotong molekul DNA.
Formulasi : suatu proses mengubah zat aktif/ekstrak dengan bantuan eksipien menjadi suatu bentuk sediaan.
fragmen : yang merujuk kepada hasil resterisasi primitive suatu bagian dari keseluruhan.
GAATTC : sekuens palindrom yang khas, dikenali oleh enzim restriksi EcoRI yang sering digunakan.
Genom : keseluruhan informasi genetic yang dimiliki suatu sel atau organisme, atau khususnya keseluruhan asam nukleat
yang memuat informasi tersebut.
Isolasi : pemisahan suatu hal dari hal lain atau usaha untuk memencilkan manusia dari manusia lain; pengasingan; pe-
mencilan; pengucilan.
Inang : organisme yang menampung virus, parasite, partner mutualisme, atau partner komensalisme, umumnya dengan
menyediakan makanan dan tempat berlindung.
Intron : setiap urutan nukleotida di dalam gen yang dibuang dalam penjalinan RNA selama pematangan produk RNA
akhir.
In vitro : istilah yang dipakai dalam biologi untuk menyebutkan kultur suatu sel, jaringan, atau bagian organ tertentu di
dalam laboratorium.
Kloning : suatu proses menghasilkan individu-individu dari jenis yang sama yag identic secara genetic.
Migrasi : perpindahan.
Mutasi : perubahan yang terjadi pada urutan nukleotida.
Replikasi : sebuah proses, cara meniru, serta menduplikasi sesuai dengan keinginan dan kebutuhan demi mendapatkan
hasil yang lebih baik.
rDNA : (DNA rekombinan) suatu bentuk DNA buatan yang dibuat dengan cara menggabungkan atau merekombinasi dua
atau lebih untaian benang DNA yag dalam keadaan normal tidak berpasangan atau terjadi bersama.
Sintesis :suatu integrasi dari dua atau lebih elemen yang ada yang menghasilkan suatu hasil yang baru.
Transkripsi : pembuatan RNA terutama mRNA dengan menyalin sebagian berkas DNA oleh enzim RNA polymerase.
 G. Daftar Pustaka

Chandra, Parija Subhash. Mikrobiology and Immunology. 2012.

Sutarno . “Rekayasa Genetic Dan Perkembangan Bioteknologi Di Bidang Peternakan.”Proceeding Biology Education Conference 2528-
5742, Vol.13(1) 2016:23-27