Genom dan

Pustaka DNA
Oleh : HAYATI
 Batasan Genom, Gen & Sistron
• Genom adalah totalitas gen pd organisme.
• Gen adalah 1 unit genetik terkecil yg memberikan 1
ciri khas ≈ satu unit terkecil yg terdiri dari rangkaian
DNA yg akan mengkode pembentukan protein
tertentu yang akan menentukan sifat fenotip dari
suatu individu
• Sistron adalah unit genetik terkecil yg apabila
mengalami mutasi menyebabkan perubahan produk
genetik
 Hewan/manusia mpy 2 buah genom yaitu : nuclear
genom dan mitokondrial genom sdgkan tumbuhan
mpy 3 set genom
 Susunan gen dlm masing-masing genom tsb mjd
suatu karakteristik
 Ukuran genom dari yang terkecil sampai yang
terbesar adalah :
1. Mitochondrial genom
2. Kloroplast genom
3. Nuclear genom
 Utk regulasinya di dalam sel ; aktivitas dari
mitochondrial genom dan kloroplast genom masih
dikontrol sebagian oleh nuclear genom.
 Gen dan Genom

 Gen :
 Genetika (genetics)
 1 atau beberapa gen
 zoom-in
 Genom:
 Genomika (genomics)
 Seluruh gen
 zoom-out
 Perpustakaan Genom

 Perpusatakan genom : Perpustakaan gen yang

dibuat dari DNA genomik
 Perpustakaan gen : koleksi berbagai sekuens
DNA dari suatu organisme yang masing-masing
telah diklon ke dalam suatu vektor untuk
memudahkan penyimpanan, pemurnian dan
analisis
 Pustaka Genom DNA

 Pustaka genom : kumpulan dari fragmen-fragmen yg telah

diklon
 Pustaka genom mengandung semua DNA pada genom
 Pustaka genom digunakan untuk menyimpan gen atau
fragmen DNA yg telah diklon
 Gen-gen tsb diisolasi dan menghasilkan ribuan
potongan/fragmen DNA  potongan ini akan disimpan
dalam pustaka plasmid atau pustaka fage
 Transkripsi Balik (Reverse Transcription)

 Defenisi : proses kebalikan transkripsi yaitu :

mengkopi RNA menjadi DNA.
 Defenisi lain : proses yang mentranskripsi untai
tunggal RNA menjadi DNA komplemennya
(cDNA) dengan katalisator enzim reverse
transcriptase, primer dNTPs dan enzim RNAase
inhibitor.
 cDNA (Complementary DNA)
 DNA untai tunggal (single-stranded) sintetik/ buatan
yg disalin dari untai mRNA menggunakan teknik
PCR dengan memanfaatkan enzim reverse
transcriptase.
 cDNA disebut juga : DNA komplemen/
complementary DNA; yaitu DNA yg dibuat
berdasarkan sekuen mRNA
 Penggunaan cDNA ini sangat luas, terutama dalam
analisis ekspresi genetik
 Proses pembuatan melalui pemanfaatan enzim
reverse transkriptase yg melakukan kebalikan dr
transkripsi yaitu membuat DNA dr template RNA
 Enzim ini dihasilkan oleh kelompok retro-virus 
dalam rekayasa genetika enzim ini digunakan utk
membuat gen artificial
 Tujuan mengkonversi mRNA menjadi cDNA adalah :
karena DNA lebih stabil (tidak mudah dilebur)
dibandingkan RNA. Setelah dikonversi, untai cDNA
dapat digunakan untuk PCR, sebagai probe untuk
analisis ekspresi dan untuk perbanyakan/ kloning
sekuen mRNA
 Pustaka cDNA
 Pustaka cDNA membawa informasi dari transkrip
DNA pada jaringan tertentu
 Pustaka cDNA hanya mengandung informasi dari
gen exon
 Tahapan :
1. Menyiapkan total mRNA dr jaringan
2. Tambahkan enzim reverse transkriptase
3. Kemudian tambahkan : deoksiribosa, nukleotida,
triphosphat, primers
 cDNA
 Penggunaan cDNA ini sangat luas, terutama dalam
analisis ekspresi genetik dan transkriptomika.
 mRNA berkas tunggal atau transkriptom bersifat
tidak stabil karena mudah dicerna dan dilebur dalam
sel. Pengubahan mRNA berkas tunggal menjadi
cDNA membuatnya lebih mudah dianalisis karena
DNA lebih stabil (tidak mudah dilebur).
 Sintesa cDNA
 Sintesis cDNA ini dilakukan dg mengunakan enzim reverse
transcriptase & primer oligo dT yg akan menempel pd
daerah ekor poli A yg merupakan ciri khas dari mRNA.
 Hal ini dilakukan supaya mRNA yg digunakan dapat di
amplifikasi saat dilakukan pengecekan dg menggunakan
PCR.
 Dalam melakukan sintesis cDNA diperlukan beberapa
tahapan, yaitu
1. isolasi mRNA yang akan digunakan,
2. visualisasi dg menggunakan elektroforesis,
3. sintesis cDNA untai pertama dan amplifikasi cDNA yang
didapatkan
 1. Isolasi mRNA

 mRNA yang digunakan merupakan hasil isolasi dari

eukariot.
 mRNA digunakan karena :
1. lebih spesifik terhadap ekspresi gen yg dihasilkan
2. pada mRNA terdapat ekor polyA disebabkan karena
adanya proses poliadenilasi yg tidak dimiliki oleh RNA
lainnya, seperti rRNA dan tRNA
2. Visualisasi dg menggunakan elektroforesis

 Visualisasi : menggunakan gel agarosa untuk

mengetahui hasil isolasi
 Elektroforesis : salah satu ilmu terapan di bidang
teknologi molekuler untuk memisahkan DNA, RNA, atau
protein dari molekul-molekul lainnya dalam suatu medan
listrik.
 Proses elektroforesis memerlukan gel (agar) sebagai
medium untuk pemisahan DNA, RNA, atau protein.
 Umumnya dikenal dua jenis gel dalam elektroforesis gel
yaitu agarosa dan poliakrilamida.
 Elektroforesis gel agarosa dijadikan sebagai metode
standar untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA atau RNA.
 Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah daripada
gel poliakrilamid, akan tetapi gel ini dapat memisahkan
DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa.
 Elektroforesis gel agarosa dapat memisahkan fragmen
DNA dan RNA yang berukuran lebih besar dari 100 bp
(base pair) hingga 50 kb dan memisahkan protein dengan
ukuran > 200 kDa dengan gerak medan yang digunakan
adalah secara horizontal.
 3. Sintesa cDNA untai pertama

 sintesis cDNA untai pertama : pada tahapan ini

diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan
mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari
cetakan mRNA dengan bantuan primer oligo dT
yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari
mRNA.
 Kemudian, mRNA didegradasi dg menggunakan
ribonuklease atau larutan basa
 Keuntungan sintesa cDNA total

 Sintesis cDNA total ini menguntungkan karena :

 dpt membantu penelitian dalam mengkarakterisasi
struktur gen atau ekspresinya,
 cDNA bersifat lebih stabil dibandingkan dg RNA yg
merupakan molekul untai tunggal yg labil & mudah
terdegradasi,
 cDNA lebih tahan dalam jangka waktu panjang/bersifat
permanen.
 cDNA merupakan molekul yg cocok utk digabungkan
atau disisipkan ke dalam berbagai vektor kloning seperti
plasmid, kosmid, dan bakteriofage,
 dapat digunakan utk screening berbagai pustaka DNA
genomik yg kompleks
 Selain itu, populasi mRNA yg telah dibentuk menjadi
cDNA dan diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yg
hanya mempresentasikan informasi pengkode/sekuen yg
terekspresi (ekson) saja, sehingga jauh lebih efektif
dalam proses klon