1

Kuliah 7

PUSTAKA DNA

FFS-UHAMKA Tim Dosen Biologi Molekuler

Topics
A. Pustaka Genome
B. Pustaka cDNA
C. Perbedaan Genomic Library vs cDNA Library
 Pendahuluan
 DNA sekuens dari organisme
dapat dikumpulkan menjadi
pustaka DNA (pustaka gen).

 Istilah ini dikenal dengan gene

library atau bank gene
Manfaat Gene Libraries
 Untuk mengetahui sekuens gen yang biasanya diperlukan untuk
amplifikasi, kloning dan ekspresi gen.
 Informasi mengenai sekuens gen dapat mendukung perkembangan
dan penemuan terapi gen
 Informasi mengenai sekuens gen dapat digunakan untuk produksi
enzim atau human gene product yang bermanfaat.
 NCBI: National Center for Biotechnology
Information (Available data base DNA sequence)

Akses NCBI untuk mendapatkan DNA sekuens dari gen-gen

yang sudah available
Pustaka Gene (cont.)

Genom libraries
(made from genomic DNA)

Pustaka Gen
(Gen Library)

cDNA libraries
(made from cDNA – copy of mRNA)

Pustaka Gen: koleksi berbagai sekuens DNA dari suatu organisme yang
masing – masing telah diklon ke dalam suatu vektor untuk memudahkan
penyimpanan, pemurnian dan analisis.
7
A. Pustaka Genom (Genom Libraries)
 Perpustakaan GENOM : perpustakaan Gen yang dibuat dari DNA
Genomik.
 Dibuat dari nuklear DNA dari organisme tertentu/spesies atau
material tertentu/sampel tertentu
 DNA diekstrak dari sampelnya kemudian secara random dipotong
dgn enzim restriksi untuk kemudian diklon ke vektor atau plasmid
 Genomic libraries mengandung ekson, intron, promotor,ori, dll
 Construction of Genomic Library
9

• A genomic library comprises a set of

bacteria, each carrying a different small
fragment of DNA.
• For simplicity, cloning of just a few
representative fragments (colored) is
shown. In reality, all the gray DNA
fragments will also be cloned
Construction of Genomic Library Overview
 Construction genomic library (cont.)

Sumber DNA: organisme/sampel di lingkungan sekitar

Step1: Extraction of genomic DNA
Step 2: cut with restriction enzyme
Step 3:
Ligation/insertion of
secuencing DNA into
vector/plasmid
which is digested
with the same
restriction enzyme
Cloning Vector Type
Approximate maximum length of DNA that can be cloned in
vectors
Cloned DNA
Vector type
(kb)
Plasmid 20
λ Phage 25
Cosmid 45
P1 phage 100
BAC (bacterial artificial chromosome) 300
YAC (yeast artificial chromosome) 100
 Plasmid Cloning Vectors

 As small as possible with

minimum restriction
endonuclease cutting sites in
genes
 ori

 Selectable marker(s)

 Multiple cloning site (MCS)

 Reporter function useful

 lacZ Complementation

 Plasmid has portion of lacZ gene

flanking MCS
 Host strain has lacZ gene missing

this seqeunce
 Expression of two components

still yields a functional LacZ

 Like it has 2 subunits

 Cloning into MCS eliminates

complementation
 X-gal in media allows for

blue/white selection
 Bacteriophage Vectors

 Commonly based upon l

phage
 Most internal genes deleted

 Insert DNA into middle

region (up to10-15 kb)
 Package

 Infect host cells with

integrated helper phage to

provide missing protein-
encoding genes
 Cosmids

 Plasmid with l phage

packaging sequence (cos)
 Can clone up to 50 kb

 Packaged into l particles

and injected into host cells
 Circularizes in cell and
continues as a large
plasmid
 BACs

 Bacterial artificial
chromosomes
 Can clone up to 200+ kb

DNA fragments
 Based upon F plasmid

 Origin, selectable marker,

promoters to expressed
cloned genes
 YACs

 Yeast artificial
chromosomes
 Have centromere,
telomeres and an origin of
replication, plus selectable
markers
 Cloned segments of 250

kb
Step 5: amplification and screening
Screening genomic library
 Setelah mendapatkan genomic library dari suatu sampel, kemudian
kita dapat melakukan screening/mengidentifikasi gen-gen yang
potensial atau penting.
 Metode yang biasa digunakan:
a. colony hibridisasi
b. plaque hibridisasi
Colony/plaque Hybridization
 Adalah screening dengan menggunakan label probe (radioactive dst)
untuk mengidentifikasi sekuens spesifik seperti DNA, RNA, enzyme,
protein, atau antibodi.
Colony Hibridization
Plaque Hybridization
Aplikasi/manfaat genomic library
1. Merupakan tahap awal DNA sekuensing
2. Membantu mengidentifikasi gen-gen baru yang penting untuk
terapetik
3. Mengidentifikasi gen baru yang tidak pernah ada sebelumnya
4. Membantu memahami keberagaman genom suatu
organisme/material
30
B. Pustaka cDNA
 Dikenal sebagai cDNA library
 Pustaka cDNA adalah perpustakaan gen yang dibuat dari DNA hasil
transkripsi balik mRNA
 Tidak mengandung sekuens genomik nontranskripsi
 Sebuah pustaka cDNA yang baik harus cukup besar dan memuat
perwakilan dari semua sekuen yang penting, dan sisipan cDNA nya
harus merupakan untai lengkap salinan mRNA asli.
cDNA

…DNA synthesized from an mRNA template

with the enzyme reverse transcriptase.
cDNA Libraries

…provide a ‘snap-shot’ of the genes expressed

in a particular cell, at a particular time, or
under specific condition,

…however, do not provide regulatory

sequences.
DNA komplemen (cDNA)
 DNA komplemen: cDNA (complementary DNA)
 cDNA merupakan DNA untai tunggal sintetik/buatan yang disalin
dari untai mRNA menggunakan teknik PCR dengan memanfaatkan
enzim reverse transcriptase.
 Konstruksi cDNA
35
Konstruksi Pustaka cDNA

 cDNA dibuat dari mRNA dewasa (mature mRNA) sel eukariot

dengan menggunakan enzim RT.
 Pada eukariot, ekor poly-A (poly-A tail) yang merupakan
untaian panjang dari nukleotida Adenin, dapat membedakan
mRNA dari tRNA dan rRNA.
 mRNA merupakan primer atau template untuk enzim RT
Konstruksi cDNA : Ekstraksi mRNA

 mRNA dipurifikasi agar terpisah dari kontaminan RNAs (tRNA

atau rRNA).
 Beberapa metode dapat digunakan:

a. Trizol extraction
b. Column purification
(menggunakan resin dimana mRNA yang
memiliki poly-A tail akan terikat)
 mRNA di elute dengan menggunakan elusion buffer dan

dipanaskan untuk memisahkan mRNA dari oligo dT

Konstruksi cDNA
 Purified mRNA kemudian dipasangkan dengan oligo dT (primer) pada
daerah poly-A untuk membentuk ujung 3’
 Kemudian enzim RT akan datang untuk mengelongasi complement
strand dari primer tersebut.
 mRNA diurai oleh RNAase  sscDNA
 sscDNA kemudian akan diubah menjadi dsDNA oleh DNA polymerase
 sscDNA akan generate hair pin loop pada ujung 3’
 DNA polymerase akan mensintesis kembali untaian DNA dari hair pin
loop tsb
 Hair pin loop akan dihilangkan oleh S1 nuclease
 Enzim restriksi endonuklease dan ligase kemudian digunakan untuk
meng-klon sekuens cDNA tersebut ke dalam plasmid --> cDNA library
cDNA Construction in vitro
 Intron and Exon in Eukaryotic Cells

exon exon exon

41 promotor intron intron DNA
3’ 5’
start codon stop codon
Transcription
5’ 3’ mRNA
Processing
cap
poly A
Splicing
tail
Intron deleted

mature mRNA To cytoplasm

Take place in nucleus
 cDNA Is Reverse Transcribed from mRNA
Baltimore, Dulbecco, Temin (1975)

mature mRNA
42 5’ 3’
poly A tail
Reverse
transcription TTTT
3’ 5’
RNA hydrolysis

3’ 5’
DNA polymerase

3’ CCC 5’
5’ GGG 3’
 Two Libraries： cDNA Library vs Genomic Library

Genes in expression Total Gene

43 mRNA Chromosomal DNA

Reverse transcription Restriction digestion

Complete
cDNA gene Gene fragments

Smaller Larger Vector:

Library Library Plasmid or phage
Vector: Plasmid
 Genomic Library vs cDNA Library

Genomic Library cDNA Library

Contains the entire genome Only contains expressed
sequences mRNA/cDNA
tRNA and rRNA genes are Does NOT contain tRNA
Present. or rRNA sequences
Contains EVERYTHING Does NOT contain non-
Promoters, introns, junk, coding sequences
Essential in genome Cannot be used for mapping
Sequencing projects
Cloned sequences are long Cloned sequences are short
up to 100kb typically 1-2 kb
Manfaat cDNA library

1. Biasa digunakan untuk eukariotik genome, mengurangi

informasi-informasi yang biasanya tidak diperlukan
untuk pustaka seperti: intron,non-coding region yang
jumlahnya cukup besar

2. cDNA library biasanya digunakan untuk

mengekspresikan gen eukariot di prokariot

3. Membantu mengisolasi gen yang dikode dari mRNA

tertentu
C. Perbedaan Genomic Library dan cDNA
Library
48