KLONING GEN

wiralis
Kloning - definisi

Dari Bahasa Yunani - klon,

ranting
Kumpulan turunan suatu
individu yang dihasilkan tanpa
melalui perkawinan; kumpulan
replika sebagian atau seluruh
makromolekul (contoh, DNA
atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh
dari satu sel somatik
induknya serta memiliki
identitas genetik yang sama
dengan induknya
Klon: Koleksi molekul atau
sel yang semua
identitasnya sama dengan
molekul atau sel
penurunnya
Kloning DNA

Metoda untuk memurnikan atau

mengidentifikasi dan memperbanyak
suatu potongan DNA tertentu (klon)
yang dikehendaki dari campuran
potongan-potongan DNA yang
Kloning Gen

Ketika
keseluruhan DNA
dari suatu
organisme
diekstraksi, akan
diperoleh seluruh
gen yang dimiliki
organisme tersebut
Tujuan mengklon Gen
Menentukan urutan basa nukleotida
penyusun gen tersebut
Menganalisis atau mengidentifikasi urutan
basa nukleotida pengendali gen tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim
yang disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang
terjadi pada kecacatan gen
yang mengakibatkan penyakit
bawaan
Merekayasa organisme untuk
tujuan tertentu : memproduksi
insulin, ketahanan terhadap
hama, dll.
Langkah-Langkah Kloning

■ Menyiapkan DNA yang akan di’klon’

■ Memotong DNA yang akan di’klon’
dan plasmid pembawa menggunakan
enzim yang sama
■ Menyambung DNA yang akan
di’klon’ dan plasmid pembawa
(Ligasi)
Pemindahan DNA ke dalam sel
inang (Transformasi)
Penumbuhan sel inang
Langkah-Langkah Kloning
DNA yang
akan di’klon’
+
Plasmid DNA hibrida
(vektor)

Penumbuhan
Sel inang
Membawa klon

Sel Inang
Bakteri Inang untuk Kloning Gen
E. coli
Informasi genetiknya sudah sangat dipahami
Tumbuh cepat dan tidak banyak persyaratan
Dapat menerima berbagai vektor, mudah
ditransformasi
Vektor untuk
Mengklon

Diperlukan suatu wahana

(vehicle) untuk memasukkan
suatu potongan DNA ke dalam
sel agar DNA tersebut dapat
disimpan dan diperbanyak di
dalam sel tersebut
Vektor untuk Mengklon

■ Vektor berupa plasmid

■ Vektor berupa bakteriofaga
■ Cosmid
■ BACs (Bacterial Artificial
Chromosome)
 Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA)
yang secara alami dimiliki suatu jasad
Bentuknya benang ganda (double strands DNA,
dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat

dengan menambahkan potongan-potongan DNA
lain ke dalam plasmid
Vektor untuk
Mengklon
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu
membawa potongan DNA lain ke dalam sel
bila memiliki:
Replikator (origin of replication)
Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
Situs untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi
sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di
dalam daerah replikator atau penanda
Plasmid yang Dimiliki oleh
Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Vektor berupa Plasmid
1. Memiliki origin of replication dari inang yang
dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi
sel pembawa plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple
cloning sites, MCS)
4. Mudah diisolasi dari sel inang.
Multiple Cloning Site (MCS)
Vektor berupa Plasmid
Vektor berupa
Plasmid
Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan DNA
ukuran kecil (< 10kbp)
Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)
Bakteriofaga (phage)
Vektor berupa bakteriofaga
(vectors)
Lengan kiri:
Protein penyusun
kepala & ekor
Lengan kanan:
Sintesis DNA
Pengendalian
Lisis inang
Daerah yang
dihilangkan:
integrasi & eksisi
Pengendalian
Vektor berupa bakteriofaga (vectors)
Vektor berupa
Bakteriofaga
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya
 Vektor Cosmid
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna
dari situs cos (dihilangkan pada vektor )
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan:
Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)
Vektor Cosmid
ZAP
Vektor BAC
(Bacterial Artificial Chromosomes)

Replikasi dimediasi oriS

(berasal dari plasmid) dan
oriC (berasal dari
kromosom)
parA and parB
mengendalikan agar
hanya terdapat satu
vektor dalam sel
Menggunakan penanda
ketahanan terhadap
KhloramfenikolR
BAC

Keunggulan:
Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA
dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapan
urutan basa nukleotida total genom
Kelemahan:
Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan
ukuran sangat besar
Shuttle Vector
Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang
(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)
Memilih Vektor
Ukuran DNA yang
disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim restriksi
yang tersedia
Jumlah salinan (copy
number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk
menapis DNA sisipan
Rencana penelitian
selanjutnya
Sumber DNA untuk diklon

DNA kromosom
DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR
cDNA (complementary DNA) yang
disintesis menggunakan mRNA sebagai
cetakan (template)
Langkah Sebelum Proses Kloning
DNA
Memperoleh informasi tentang protein yang diinginkan

Isolasi Protein Protein Data Base

 Pemurnian protein ■ Cari data protein
 Penentuan urutan asam ■ Cari urutan asam
amino amino

 Desain DNA pelacak

 Desain primer
 Melakukan PCR
DNA Kromosom

DNA yang
akan
di’klon’
Perbanyakan DNA dengan
PCR (Polymerase Chain
Reaction)
Pemanasan 92 C Suhu 72 C
o o

Benang ganda memisah (Optimum untuk

DNA polimerase)
Pendinginan 50oC Pemanjangan DNA
Primer menempel

1 molekul 2 molekul
DNA gen DNA gen
Benang ganda Benang ganda
LANGKAH 1
 PCR (Polymerase Chain
Reaction)
---GAAGGCCTG---GATGCCATG--
---CTTCCGGAC---CTACGGTAC--
Pemanasan 92oC
Benang ganda memisah
Peendinginan 50oC
Primer menempel
Pemanasan 72oC
Pemanjangan DNA

---GAAGGCCTG---GATGCCATG--
C T T C C G GA C -
- G GA C C C A T G
---CTTCCGGAC---CTACGGTAC--
Perbanyakan DNA dengan
PCR (Polymerase Chain
Reaction)
Pemanasan 92 C Suhu 72 C
o o

Benang ganda memisah (Optimum untuk

DNA polimerase)
Pendinginan 50oC Pemanjangan DNA
Primer menempel

2 molekul 4 molekul
DNA gen DNA gen
Benang ganda Benang ganda
LANGKAH 2
Perbanyakan DNA dengan
PCR (Polymerase Chain
Reaction)

4 molekul 8 molekul
DNA gen DNA gen
Benang ganda LANGKAH 3 Benang ganda
Mensintesis cDNA
Bahan/Alat untuk
Meng’klon’
Enzim endonuklease restriksi
Enzim ligase
Vektors
Inang (Host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
Memotong DNA
Menggunakan enzim
endonuklease restriksi
Ujung “lengket” (sticky ends)
Ujung “tumpul” (blunt ends)

Penamaan enzim
EcoRI
E = genus (Escherichia)
co = species (coli)
R = strain
I = # of enzyme
Ujung “tumpul” dan “lengket”
(Blunt & Sticky ends)
Penyambungan (pasting)
DNA
Pembentukan ikatan-
H pada ujung-ujung
yang komplemen
(sticky ends)

Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA
Kloning Terorientasi
Bila diinginkan untuk menginsersikan
potongan DNA asing dengan orientasi
tertentu
Dilakukan dengan memotong DNA vektor
maupun DNA sumber gen yang
dikehendaki menggunakan dua enzim
restriksi yang berbeda
Plasmid Khimera (Chimeric
Plasmids)
Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk
dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian
makhluk binatang lain
Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu
enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki
ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA
asing disambung, akan dihasilkan "plasmid
rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel
inang yang sesuai
See ya ………