Kuliah-4

Teknologi DNA Rekombinan 1

(Tahap Kloning Gen)
Jeffeta Pradeko Putra, S.Farm., M.Si
Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia
2017

1
 Outline
1. Pendahuluan
2. Prinsip teknologi DNA rekombinan;
3. Isolasi DNA/gen,
4. Pengertian dan jenis vektor
5. Tahap kloning gen (penyiapan DNA
sisipan;penyiapan vektor, ligasi, transformasi
dan seleksi klon);
2
1. Pendahuluan

3
 Definisi Teknologi Rekombinan DNA?
• Teknologi = perubahan bentuk atau struktur; konversi dari
satu bentuk ke bentuk lain
• Rekombinan  Re dan Kombinasi
Re = Ulang
Kombinasi = gabungan beberapa hal

“Teknik perubahan ulang gabungan segmen DNA dari 2

sumber berbeda yang menghasilkan produk genetik baru.”

4
 Definisi
• Vektor adalah tools di mana gen dapat ditransfer dari satu sel
ke sel lain
– Host Cell  Sel target akhir
– Bakteri
• Plasmid molekul sirkular DNA bakteri (up to 10 kb)
• Bacteriophage  DNA dari bakteri terinfeksi virus (up to 20 kb)
• Cosmid  Plasmid kecil mengandung daerah cos (cohesive termini)
sites dari DNA phage (35 – 45 kb) dll
• Enzim Restriksi = protein yang mengkatalisis pemotongan
ikatan kovalen dan ikatan hidrogen antara DNA
5
 Enzim Restriksi
• Enzim Restriksi memotong kedua untai / strand DNA di titik
tertentu, spesifik terhadap sekuens basa tertentu

• > 1,000 Enzim Restriksi

• Masing-masing memotong pada titik untaian dna spesifik

6
Enzim Restriksi

(https://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/anima25.swf)
2. Prinsip teknologi DNA rekombinan;

8
 Recombinant DNA Technology

1 Restriction enzymes cut specific base
sequences everywhere they occur
in human chromosomes. 3 The plasmid DNA and the human
DNA fragments are mixed in a
solution with enzymes that link
them together.
5 Recombinant DNA
inserted into host
cells is copied each
time the host cells
divide.
Cultured
organ

2 The same
restriction enzymes
cut the same base Growth Hormone
sequences in plasmid 4 The result is recombinant DNA
DNA. molecules with both human and
rh-EPO
plasmid DNA. 9
 3. Isolasi DNA/gen

http://maswheat.ucdavis.edu/education/animatio
ns/DNAextraction.swf

10
11
Ekstraksi DNA BCG

12
4. Pengertian dan jenis vektor

13
 Vektor
• Berasal dari DNA yang secara alami dapat
bereplikasi dalam sel organisme tertentu
• Sudah mengalami banyak modifikasi
sesuai dengan kebutuhan
• Dapat disisipkan DNA asing
• Plasmid
– Bereplikasi di luar kromosom
• Episom
– Dapat terintegrasi ke dalam kromosom
• Virus
• Shuttle vector
– Dapat digunakan pada lebih dari satu
macam inang
– Misalnya E. coli dan Saccharomyces
cerevisiae
• Vektor ekspresi
– Ditambahkan elemen-elemen genetik
yang diperlukan untuk mengekspresi
gen pada spesies tertentu

14
 Dasar pemilihan vektor
– Ukuran DNA asing yang akan dimasukkan ke dalam sel
– Galur sel inang yang akan digunakan
– Eksperimen yang akan dilakukan setelah kloning
• Apakah gen akan diekspresi?
• Apakah diperlukan modifikasi pasca translasi pada protein yang akan
dihasilkan?

15
– Vektor dari organisme lain
• Yeast Artificial Chromosomes (YACs)  200 - 1500 kb.
• Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)  100 - 300 kb.
• Plant Cloning Vectors
• Mammalian Cell Vectors

16
5. Tahap kloning gen

17
 Tahap kloning gen
1. Penyiapan DNA Target
– Teknik Isolasi DNA/Gen
– Restriksi Oleh Enzim endonuklease
– Teknik PCR
2. Penyiapan vektor
3. Ligasi  Lem
4. Transformasi  Memasukan Hasil DNA dan Memperbanyak sel vektor
5. Seleksi klon  Memilih sel vektor kloning
6. Identifikasi  Sekuensing, Southern Blot, dll
7. Aplikasi

https://www.bioteach.ubc.ca/TeachingResources/Applications/GMOpkgJKloseGLampard2.swf
https://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/anima23.swf
https://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/anima22.swf
http://www.ydae.purdue.edu/apple_genomics/flash/movie6.swf
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/gelelectrophoresis_life9e.swf
https://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/anima27.swf

18
 Cell Transformation
Many different cells can have DNA inserted into them, called “transformation.”
1. Some bacteria are naturally competent and have the ability to take in new DNA.
2. If a cell has a cell wall, such as plants, algae, or fungi, enzymes break down the
walls, producing protoplasts (cells without cell walls). A short electrical pulse opens
up pores in the cell membrane, allowing DNA to enter in what is called
“electroporation.” Cells are then washed so the cell wall reforms and cell division
starts.
3. Plant cells can also be transformed by biolistics. Small gold or tungsten particles
covered in DNA are shot into cells or tissue at high velocity. Cell walls do not have
to be removed.
4. Animal cells can be transformed by electroporation or DNA precipitation with a
calcium phosphate solution. Viruses can also be used.
5. Microinjection of DNA in the cell nucleus, such as an animal egg, is needed to
introduce DNA into an entire animal. The DNA integrates into the animal
chromosomes, the egg is implanted, and the animal is born with the desired traits.
19
 All weeks
• https://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/animaciones.htm
• http://www.eduhk.hk/biotech/emain.html

20