Kelompok 3 Palembang

Nama Anggota :

1. Elsha Melinda (06101381823058)

2. Tiara Rahmi Rembayu (06101381823057)
3. Yeni Oktaria (06101381823045)

PERTEMUAN 12

ENZIM RESTRIKSI DAN VEKTOR

1. ORIENTASI MASALAH
Bacalah materi dan amatilah video pembelajaran pertemuan 12, yang telah disajikan,
Dari tayangan tersebut analisislah apakah enzim restriksi?, samakah dengan enzim
yang lain? Apakah vector? Apakah sel inang?
 Enzim Restriksi
Enzim restriksi adalah enzim yang dapat mengenali dan memotong kedua utas
DNA (Deoxy Ribonucleic Acid) pada urutan basa tertentu. Enzim ini mencari
sekuens spesifiknya dengan cara menempel pada DNA secara spesifik maupun
nonspesifik, kemudian berdifusi secara linier dengan kecepatan tertentu
hingga ditemukan sekuens spesifik yang dikenalinya. Setelah sekuens spesifik
dikenali, perubahan konformasi enzim dan DNA akan terjadi (Pingoud et al.,
1993). Ikatan yang didapat saat enzim restriksi memotong DNA yaitu Ikatan
kovalen (dalam satu untai) dan Ikatan hidrogen (antar untai) sebagai akibat
dari untaian yang terlepas
  Vektor Kloning
Enzim restriksi merupakan suatu vektor. Vektor kloning merupakan suatu
komponen pembawa gen yang akan dimasukan ke dalam sel inang. Suatu
vektor kloning harus memiliki bagian titik mula replikasi atau ORI (Origins of
replication) yang menandai tempat dimulainya replikasi DNA, gen seleksi
(selectable marker) yang membantu mengidentifikasi sel yang akan diubah
dari sel aslinya, dan situs restriksi (restriction site) atau daerah kloning
merupakan urutan DNA khas yang akan dikenali oleh enzim restriksi.
 Sel Inang
Dalam biologi, adalah organisme yang menampung virus, parasit, partner
mutualisme, atau partner komensalisme, umumnya dengan menyediakan
makanan dan tempat berlindung. Contohnya suatu sel dapat menjadi inang
bagi virus, gulma dapat menjadi inang bagi bakteri pengikat nitrogen, dan
hewan dapat menjadi inang bagi cacing parasitik seperti nematoda.

2. PENCETUSAN IDE
Berdasarkan pengamatan saudara diskusikan dengan kompok saudara hal-hal berikut
ini:
Setelah saudara cermati video pembelajaran di atas, bagaimanakah kerja enzim
restriksi?, Apa jenis enzim restriksi yang biasa digunakan dalam rekayasa genetika?
Untuk apakah Vector tesebut? Apa ciri-ciri vector yang dapat digunakan? Ada berapa
banyak jenis vector tersebut?
 Bagaimanakah kerja enzim restriksi?
Mekanisme Kerja Enzim Restriksi :
Enzim restriksi memotong DNA dalam dua cara dan hasil yang berbeda,
yaitu :
a) Hasil pemotongan berujung tumpul (blunt atau flush end), Enzim ini
memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga
menghasilkan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola
seperti ini adalah SmaI
b) Hasil pemotongan berujung lancip atau lengket (sticky atau cohesive
ends), Pola seperti ini lebih mudah menempel (annealing) dengan
pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang
menggantung.
 Ujung menggantung 5’, Enzim ini memotong secara asimetris
pada situs pemotongan, menghasilkan hasil pemotongan
memanjang pada ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan
ujung menggantung 5’ adalah BamHI
 Ujung menggantung 3’, Enzim ini juga memotong secara
asimetris pada situs pengenalan, namun menghasilkan hasil
pemotongan memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang
menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI
 Apa jenis enzim restriksi yang biasa digunakan dalam rekayasa genetika?
Secara umum, jenis enzim restriksi yang biasa digunakan dalam rekayasa
genetika dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada komposisi sub
unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya
kofaktor.
1) Enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multi sub unit,
kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA
pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. Enzim ini secara
biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel, tetapi kurang
menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium.
2) Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau
berada di antara sekuen yang dikenalnya. Enzim ini menghasilkan
fragmenfragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel
 agarosa. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan
dalam analisis DNA dan kloning gen.
3) Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim
pemodifikasi. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal
dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan
pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini
jarang menghasilkan potongan yang sempurna.
 Untuk apakah vector tesebut?
Vektor kloning dalam teknik rekayasa genetika berfungsi sebagai situs
pengenalan endonuklease restriksi, dimana informasi genetik dapat disisipkan.
Selain itu, vektor kloning berfungsi sebagai titik mula replikasi atau ORI
(Origins of replication) yang menandai tempat dimulainya replikasi DNA, gen
seleksi (selectable marker) yang membantu mengidentifikasi sel yang akan
diubah dari sel aslinya, dan situs restriksi (restriction site) atau daerah kloning
merupakan urutan DNA khas yang akan dikenali oleh enzim restriksi.

 Apa ciri-ciri vector yang dapat digunakan?

Karakteristik penting yang harus dimiliki oleh suatu vektor kloning sehingga
dapat digunakan adalah :
1) Stabil dalam sel inang
2) Mengandung gen resistensi antibiotik tertentu, sehingga memudahkan
seleksi dari gen rekombinan
3) Memiliki titik ori (sebagai titik awal replikasi), sehingga bisa
bereplikasi atau multiplikasi sendiri. Dengan kata lain, plasmid
tersebut dapat berbiak autonom serta dapat mengontrol replikasinya
sendiri
4) Memiliki daerah restriksi atau MCS, yang dapat dipotong dengan
enzim restriksi endonuklease tertentu
5) Berukuran kecil
6) Dipotong pada situs tunggal oleh endonuklease restriksi
7) Tidak ditransfer dengan konjugasi
8) Cirinya dengan mudah dideteksi
9) Dengan mudah di isolasi dari sel
  Ada berapa banyak jenis vector tersebut?
Terdapat beberapa jenis vektor kloning yang telah diketahui yaitu plasmid,
bakteriofaga, kosmid, vektor, YAC, virus hewan dan virus tumbuhan.
a. Plasmid, merupakan vektor kloning yang paling sering digunakan
dalam proses kloning pada bakteri. Plasmid adalah DNA
ekstrakromosomal yang biasanya berbentuk sirkuler, dan plasmid ini
ditemukan dalam sel bakteri. Bakteri memiliki kemampuan
pembelahan yang cepat, sehingga plasmid sering digunakan sebagai
vektor pembawa gen untuk memproduksi suatu produk tertentu dalam
waktu yang cepat.
b. Bakteriofaga, merupakan virus yang menginfeksi bakteri dengan
memasukan DNA nya ke dalam bakteri inang. DNA virus dapat
dimanipulasi dengan cara disisipi gen asing kemudian dimasukan ke
dalam bakteri. Bakteriofafa yang dikembangkan untuk vektor kloning
yaitu bakteriofag lambda dan M13.
c. Kosmid, merupakan kombinasi dari beberapa bagian vektor plasmid
dan situs COS bakteriogaf lambda. Kosmid memungkinkan DNA
target masuk ke dalam kepala lambda. Keuntungan dari penggunaan
kosmid adalah tingkat efisiensi transformasinya yang tinggi dan dapat
membawa 45kb DNA asing.
d. Vektor YAC, merupakan vektor yang dikembangkan untuk
mengkloning segmen DNA yang sangat besar.
e. Virus hewan, DNA virus hewan dapat dimanipulasi untuk memasukan
DNA asing ke dalam sel hewan yang dibudidayakan. Contohnya,
Simian virus 40 (SV 40), Adenovirus dan Papiloma virus.
f. Virus tumbuhan, virus ini dapat dimanipulasi untuk memasukan DNA
asing ke dalam sel tumbuhan. Contohnya, Tobacco Mosaic Virus
(TMV) dan Cauliflower Mosaic Virus (CaMV).

3. PENSTRUKTURAN IDE
Dari pencetusan ide tersebut diskusikan dalam kelompok saudara sebagai berikut:
Buatlah tabel yang berisi jenis-jenis enzim restriksi type 2 dan daerah pengenalannya.
Buatlah tabel yang berisi jenis-jenis vektor dan ukurannya
 Jawab :
Enzim ini memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan. Enzim ini menghasilkan
fragmen-fragmen sesuai dengan yang diinginkan sehingga biasa digunakan untuk
analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI,
HindIII, EcoRI, dan NotI; dan enzim-enzim tersebut tersedia secara komersial. Enzim
ini tergolong kecil dengan subunit yang memiliki 200-350 asam amino dan
memerlukan Mg2+ sebagi kofaktor. Selanjutnya enzim jenis tipe II yang umum,
biasanya digolongkan sebagai tipe IIs, adalah FokI dan AlwI. Enzim ini memotong di
luar situs pengenalan, berukuran sedang, 400-650 asam amino, dan memiliki 2
domain khusus. Domain pertama untuk berikatan dengan DNA, sedangkan domain
yang satunya untuk memotong DNA.

4. APLIKASI

Jika urutan DNA berikut ini di reaksikan dengan enzim resktriksi Bam H1 apa yang
terjadi? analisislah Fragmen DNA yang dihasilkan?

5’ TCG-AAA-CAG-AGA-CCG-TTG-TAG-TTA-CTG-ACC-TAA-TAG-CAA-GTG-
TCT-TAA-CTA-AAG-GGA-GAG-CTA-GTA-TAC-TCA-ACG-TCT-AGA-CTA-
TTG-GAG-CTG-AAC-TCC-CGG-CTC-GGT 3’

Anti sense
3’ AGC – TTT – GTC – TCT – GGC – AAC – ATC – AAT – GAC – TGG – ATT
– ATC – GTT – CAC – AGA – ATT – GAT – TTC – CCT – CTC – GAT – CAT –
ATG – AGT – TGC – AGA – TCT – GAT – AAC – CTC – GAC – TGG – AGG –
GCC – GAG – CCA 5’
Direaksikan dengan enzim Restriksi BamHI
Ketika urutan DNA diatas direaksikan dengan enzim restriksi BamHI maka tidak
terjadi pemotongan fragmen DNA karena pada urutan DNA tersebut tidak ada
sekuens pengenalan BamHI yaitu GGATCC, maka dari itu urutan DNA diatas tidak
terjadi reaksi ketika direaksikan oleh enzim restriksi BamHI