Pertanyaan untuk video: Ket step of Molecular Cloning

Salah satu teknik bioteknologi molekuler adalah Teknik Rekombinan DNA, di mana gen
(DNA) dari suatu organisme tertentu digabung dengan gen (DNA) organisme yang lain
kemudian dimasukkan ke dlam suatu sel dengan maksud untuk diperbanyak (dikloning)atau
untuk diekspresikan.

Berikut adalah video proses perbanyakan suatu gen melalui Molecular cloning. Cermati
videonya kemudian jawablah pertanyaan-pertanyaan berikut.

1. Apa artinya dan beri contohnya:

a. Molecular cloning: Kloning molekul adalah proses isolasi fragmen DNA spesifik dan
transfer fragmen ke dalam vektor plasmid.
b. Insert atau sisipan adalah sepotong DNA yang dimasukkan ke dalam vector DNA
yang lebih besar daripada teknik DNA rekombinan seperti ligase atau rekombinasi.
Contohnya gen yang telah diisolasi dengan teknik biologi molekuler dan dapat
dikloning dalam sel mikroba.
c. Vektor adalah potongan DNA melingkar yang dapat dengan mudah diamplifikasi
dalam E.Coli, disimpan untuk waktu yang lama, dan mudah dimanipulasi dalam
tabung reaksi. Vektor juga memiliki arti sebagai alat yang membawa DNA ke dalam
sel induk barunya yang dapat diekspresikan/bereplikasi dalam sel induk baru (sel
inang). Vektor plasmid yang khas mengandung:
1. asal replikasi yang memungkinkan untuk direplikasi di dalam sel bakteri
2. penanda pilihan, misalnya kode gen beta laktamase untuk resistensi ampisilin
3. beberapa situs kloning, yang dapat dibelah dengan beberapa enzim restriksi,
seperti BamHI, (G-GATCC), EcoRI (G-AATTC) atau Ncol (C-CATGG)
a. Ori (origin of replication) adalah urutan tertentu dalam genom di mana
replikasi dimulai. Ori sebagai titik awal replikasi sehingga bisa bereplikasi atau
multiplikasi sendiri.
b. MCS (Multiple Cloning Site) atau dapat disebut juga polilinker adalah segmen
pendek dari DNA yang mengandung banyak (hingga ~ 20) situs restriksi - fitur
standar dari plasmid yang direkayasa dan tempat penyisipan gen.
 c. Gen Marker: Penanda genetik adalah gen atau urutan DNA dengan lokasi
yang diketahui pada kromosom yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi
individu atau spesies. Ini dapat digambarkan sebagai variasi (yang mungkin
timbul karena mutasi atau perubahan lokus genomik) yang dapat diamati.
Penanda genetik dapat berupa sekuens DNA pendek, seperti sekuens yang
mengelilingi perubahan pasangan basa tunggal (single nucleotide
polymorphism, SNP), atau yang panjang, seperti minisatellites.
Menurut Semagn et al (2006), definisi marka (penanda) molekuler adalah
sekuen DNA yang dapat diidentifikasi, dan terdapat pada lokasi tertent pada
genom, dan dapat diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya.
Ibaratnya sebuah barcode, keberadaan marka molekular tersebut secara
prinsip memiliki perbedaan, sehingga untuk memilih dan pengaplikasian
harus dengan hati-hati. Definisikan marka genetik merupakan gen yang
terekspresi dan membentuk fenotip, biasanya mudah dibedakan, digunakan
untuk identifikasi individu atau sel yang membawanya, atau sebagai probe
untuk menandai inti, kromosom, atau lokus.
d. Rekombinan DNA adalah bentuk DNA buatan yang dibuat dengan
menggabungkan dua atau lebih sekuens DNA. Suatu teknik pembentukan
kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke
dalam suatu vektor, sehingga memungkinkan terjadinya integrasi dan
mengalamai perbanyakan falam suatu sel organisme lain sebagai sel inang.
e. transforman
Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid,
1. Mengapa
a. Dalam molecular cloning: Insert dan vektor masing-masing harus dipotong dg
2 jenis enzim yang sama ?
Pemotongan insert dan vektor menggunakan enzim yang bernama enzin
restriksi. Enzim ini merupakan enzim yang digunakan untuk memotong DNA
secara spesifik. Enzim restrikai yang digunakan untuk memotong insert dan
vektor harus sama agar urutan basanya bisa sesuai sehungga insert dan
vektor bisa bersatu (komplemen). Contoh enzim EcoRI.
 b) Karena enzim ligase bertugas memadukan atau menyambungkan insert
dan vector secara utuh dan membantu proses pemaduan tersebut. Jika tidak
ada enzim ligase maka vector dan insert tidak bergabung secara utuh
kemungkinan dapat terlepas atau cacat
b. Meskipun insert dan vektor sudah maching, masinh diperlukan enzim ligase.
Karena enzim ligase berfungsi untuk menyambungkan fragmen-fragmen
tersebut secara kovalen sehingga ikatan antara fragmen-fragmen tersebut
menjadi kuat.
c. Enzim restriksi adalah enzim pemotong DNA yang mengenali urutan target
spesifik dan memotong DNA menjadi dua bagian di atau dekat lokasi itu.
Banyak enzim restriksi menghasilkan potongan dengan pendek, untaian
tunggal. Jika dua molekul memiliki overhang yang cocok, mereka dapat
berpasangan dan menempel bersama. Namun, mereka tidak akan bergabung
untuk membentuk molekul DNA yang tidak terputus sampai mereka
bergabung dengan DNA ligase, yang menutup celah di DNA backbone.
2. Bagaimana caranya Membedakan sel trnasforman dan sel non transforman
Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan
sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi
transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan
pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru
pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman.