Nama : Loviana Rekha

NIM 2110246791
MK : Bioteknologi
Dosen Pengampu : Dr. Ir. Zulfarina, M.Si

Dalam suatu eksperimen Anda akan mengekspresikan sebuah gen (misalkan

gen penyandi protease) di Escherichia coli melalui strategi overexpression.
Anda sudah mempunyai gen tersebut lengkap sebagai open reading frame
(ORF). Dalam hal ini Anda akan menggunakan plasmid untuk ekspresi yaitu pET-
15b dimana pada multiple cloning site (MCS) nya terdapat situs pemotongan
yaitu NdeI, BamHI, dan XhoI. Inang host yang digunakan yaitu Escherichia coli
BL21 (DE3). Coba anda jelaskan secara sistematis urutan yang dilakukan hingga
anda dapat menyimpulkan bahwa gen tersebut telah diklon dan diekspresikan
di bakteri tersebut yaitu Escherichia coli BL21 !

Jawab :

Proses dasar kloning adalah isolasi urutan DNA dari spesies apa pun dan
penyisipan ke dalam DNA pembawa, yang disebut vektor, untuk diperbanyak di
dalam spesies inang, yang biasanya berupa bakteri atau ragi. Klon-klon tersebut
kemudian dapat digunakan untuk analisis genetik, untuk menghasilkan protein,
untuk mutasi, dan banyak tujuan lainnya.
Secara teoritis prosedur dan mekanisme kloning terhadap makhluk hidup
melalui empat (4) tahap yaitu :

1. Isolasi fragmen DNA

Eksperimen kloning dimulai dengan mengidentifikasi bagian DNA yang
menjadi target kloning. Seringkali, ini adalah gen lengkap. Metode yang paling
umum untuk menyalin gen adalah dengan reaksi rantai polimerase (PCR). Isolasi
fragmen DNA yang spesifik dapat dilakukan dengan metode PCR (polymerase
chain reaction) yaitu teknik amplikasi fragmen DNA yang spesifik secara in vitro.
Secara umum DNA yang digunakan untuk PCR adalah total DNA genom yang
diekstraksi dari sel dan tidak membutuhkan tingkat kemurnian tinggi. Urutan
DNA yang akan diamplikasi secara spesifik akan ditentukan oleh primer-primer
yang tersusun dari nukleotida. Setelah DNA diamplifikasi, ujungnya disiapkan
untuk ligasi dengan enzim restriksi. Enzim restriksi dipilih untuk
kompatibilitasnya dengan vektor yang diinginkan. Segmen gen yang diamplifikasi
kemudian diinkubasi dengan enzim restriksi untuk memotong ujungnya sehingga
ada overhang yang sesuai untuk ligasi. Material yang diperlukan untuk proses
PCR adalah DNA yang mengandung rangkaian urutan yang akan diperbanyak
(duplikasi DNA) yaitu primer, DNA polimerase dan campuran dari empat macam
deoksiribonukleotida-trifosfat (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) serta MgCl2.

2. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vector

Proses penyisipan atau penyambungan molekul fragmen DNA dengan
molekul DNA vektor disebut ligasi. Ligasi adalah proses menggabungkan dua
bagian DNA dari sumber yang berbeda bersama melalui pembentukan ikatan
kovalen. DNA ligase adalah enzim yang digunakan untuk mengkatalisasi reaksi
ini. Ligasi DNA membutuhkan ATP. Selama ligasi, gen yang diamplifikasi untuk
dikloning diinkubasi dengan vektor. Ujung masing-masing telah disiapkan dengan
enzim restriksi untuk memiliki potongan-potongan saling melengkapi DNA
beruntai tunggal. Asam nukleat pada bagian yang saling bergantungan ini
berpasangan satu sama lain, dan enzim ligase digunakan untuk menutup celah
antara asam nukleat.
Biasanya ligasi terjadi antara ujung gugus fosfat dengan gugus hidroksil.
Ligasi antara fragmen DNA yang memiliki ujung lengket (cohesive ends) yang
komplementer jauh lebih efesien dibandingkan dengan ujung tumpul (blunt ends).
Efisiensi ligasi juga dipengaruhi oleh adanya deoksiadenosin tunggal pada ujung.
Efisiensi ligasi dapat ditingkatkan, bila fragmen DNA yang memiliki
deoksiadenosin tunggal pada ujung bertemu dengan vektor yang memiliki timidin
pada ujung. Vektor yang biasa digunakan adalah plasmid yang merupakan
potongan DNA bundar tertutup yang ditemukan diluar genom sel bakteri, kadang-
kadang disebut sebagai DNA kromosom ekstra.

3. Transformasi DNA
Transformasi adalah proses pemindahan molekul DNA donor dari
lingkungan luar sel. Vektor kloning yang merupakan pembawa gen yang akan
dikloning ditransformasi ke dalam sel inang. Transformasi dapat dilakukan secara
alami maupun buatan. Pada proses transformasi alami, DNA yang berbentuk 128
untai ganda dan memiliki untaian basa spesifik terhadap protein membran masuk
ke dalam bakteri melewati membran sel bakteri terhidrolisis. Pada transformasi
buatan, sel bakteri dibuat menjadi sel kompeten secara paksa sehingga selubung
sel bakteri bersifat permeabel dan memungkinkan DNA dapat berikatan dengan
sel dan masuk ke dalam sitoplasma kemudian berinteraksi dengan genom sel
bakteri. Sel kompeten adalah sel inang yang memiliki kompetensi untuk dimasuki
vektor kloning. Perlakuan untuk memasukkan sel kompeten dapat dilakukan
dengan menggunakan metode kejutan panas (heat shock) atau kejutan pulsa listrik
(metode electroporation). Ada dua metode utama untuk mengubah (transformasi)
sel bakteri yaitu sengatan panas dan elektroporasi.

4. Seleksi Hasil Kloning

Penyeleksian koloni bakteri untuk mendapatkan kloning yang diinginkan
dengan cara X-gal atau pemotongan dengan enzim restriksi. Seleksi dengan X-gal
dapat digunakan untuk mengidentifikasi plasmid rekombinan dengan
komplementasi. Sedangkan pemotongan dengan enzim restriksi dapat digunakan
untuk menyeleksi plasmid rekombinan hasil kloning. Hasil pemotongan tersebut
dielektroforesis dan memperlihatkan pita fragmen DNA sisipan yang terpisah dari
pita vektor kloning.
Jika berhasil memasukkan DNA target ke dalam plasmid menggunakan
salah satu situs enzim restriksi di daerah, gen lacZ tidak lagi memasok informasi
yang diperlukan untuk menghasilkan beta-galactosidase fungsional. Oleh karena
itu sel bakteri yang mengandung plasmid dengan sisipan tidak akan dapat
menghidrolisis substrat X-gal, dan mereka akan menghasilkan koloni putih (atau
kadang-kadang biru muda).
Jika DNA target tidak berhasil dikloning ke dalam plasmid, plasmid
memberikan informasi yang dibutuhkan sel inang bakteri untuk memproduksi
beta-galactosidase, dan sel-sel akan dapat menghidrolisis substrat X-gal, dan akan
menghasilkan koloni biru gelap. Plasmid kloning akan mengandung dua penanda:
Penanda antibiotik yang hanya memungkinkan bakteri dengan plasmid tumbuh
pada medium yang mengandung antibiotik yang sesuai, dan Marker kloning,
seperti lacZ, yang memungkinkan membedakan plasmid dengan insert dari
plasmid tanpa insert.
Jika ukuran asli dari plasmid yang belum dipotong adalah 3.0kb, dan
menambahkan sisipan 0.75kb, akan dapat memverifikasi penambahan sisipan
dengan menganalisis plasmid yang tidak dipotong, memotong plasmid, plasmid
yang dipotong dengan memasukkan, dan memotong plasmid dengan
memasukkannya ke gel agarosa
Pada Eksperimen diatas yaitu mengklon gen penyandi protease menggunakan
plasmid vector E. coli BL21 (DE3). Urutan nya sebagai berikut :
1. Ligase (pemotongan) ORF gen penyandi protease kevektor expresi plasmid
(pET-15b)
2. Transformasi plasmid rekombinan, pET-15b-gen protease ke E. coli BL21
(DE3), yaitu gabungan dari gen penyandi protease dengan gen atau vector
yang ada dalam plasmid.
3. Karakteristik plasmid rekombinan pET-gen protease
a. Pemotongan plasmid rekombinan pET-15b-gen penyandi protease dengan
enzim restriksi (NdeI, BamHI, dan XhoI)
b. Analisis DNA sisipan ORF gen protease dengan squensing
Squen DNA yang disisipkan dengan ORF protease muncul hasilnya
apakah hasil kloningnya 100% atau 50% atau sekian persen.