KLONING GEN DAN

REKOMBINASI DNA
TEKNOLOGI REKOMBINASI DNA
•Rekombinasi DNA
Membuat konstruksi DNA melalui penggabungan
fragmen DNA dalam susunan yang memungkinkan
DNA tersebut terekspresi
 Rekombinasi DNA berkaitan erat dengan

Kloning DNA, transformasi DNA, sekuensing DNA,

ekspresi gen, rekayasa genetik organisme (untuk
produksi senyawa bernilai  bioproses, rekayasa
protein/perubahan kodon, pemuliaan 
transgenik,terapi gen
 Prinsip dasar : potong sambung DNA pada situs
tertentu/terbatas/restriktif
TEKNOLOGI REKOMBINASI DNA

> Komponen kunci

1. Situs restriksi yang sesuai dan posisi yang tepat
pada DNA yang akan direkombinasikan
2. Enzim restriksi endonuklease (Memotong DNA)
3. Enzim DNA Ligase (Menyambung potongan DNA)
4. Fosfatase (Menghilangkan gugus fosfat,
mengurangi bselfligation)
5. Enzim Kinase (Meningkatkan efisiensi ligasi)
KLONING - DEFINISI

 Dari Bahasa Yunani - klon, ranting

 Kumpulan turunan suatu individu yang
dihasilkan tanpa melalui perkawinan;
kumpulan replika sebagian atau seluruh
makromolekul (contoh, DNA atau
antibodi)
 Suatu individu yang tumbuh dari satu sel
somatik induknya serta memiliki identitas
genetik yang sama dengan induknya
 Klon: Koleksi molekul atau sel yang
semua identitasnya sama dengan molekul
atau sel penurunnya
 Memproduksi sejumlah besar DNA atau
sel yang identik dari satu molekul atau sel
tetua
Kloning DNA
\

Metoda untuk memurnikan atau

mengidentifikasi dan memperbanyak
suatu potongan DNA tertentu (klon) yang
dikehendaki dari campuran potongan-
potongan DNA yang kompleks.
KLONING GEN

Ketika keseluruhan DNA

dari suatu organisme
diekstraksi, akan
diperoleh seluruh gen
yang dimiliki organisme
tersebut

Pada kloning gen, hanya

gen (DNA) tertentu yang
diisolasi, dimurnikan,
dan diperbanyak (diklon)
TUJUAN MENGKLON GEN

 Menentukan urutan basa nukleotida

penyusun gen tersebut
 Menganalisis atau mengidentifikasi
urutan basa nukleotida pengendali gen
tersebut
 Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim
yang disandi gen tersebut
 Mengidentifikasi mutasi yang terjadi
pada kecacatan gen yang
mengakibatkan penyakit bawaan
 Merekayasa organisme untuk tujuan
tertentu, misalnya memproduksi
insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
SUMBER DNA UNTUK DIKLON

 DNA kromosom
 cDNA (complementary DNA) yang
disintesis menggunakan mRNA
sebagai cetakan (template)
 DNA yang dihasilkan dari
perbanyakan menggunakan PCR
MENSINTESIS CDNA
PERBANYAKAN DNA DENGAN PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
BAHAN / ALAT UNTUK MENGKLON

 Enzim endonuklease restriksi

 Enzim DNA ligase
 Vektor
 Inang (Host)
 Metoda untuk memasukkan DNA ke
dalam sel inang
VEKTOR UNTUK MENGKLON

Diperlukan suatu wahana

(vehicle) untuk
memasukkan suatu
potongan DNA ke dalam sel
agar DNA tersebut dapat
disimpan dan diperbanyak
di dalam sel tersebut
KLONING TERORIENTASI

 Bila diinginkan untuk

menginsersikan potongan DNA
asing dengan orientasi tertentu
 Dilakukan dengan memotong
DNA vektor maupun DNA
sumber gen yang dikehendaki
menggunakan dua enzim
restriksi yang berbeda
VEKTOR UNTUK MENGKLON

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial
Chromosome) & YAC (Yeast
Artificial Chromosome)
VEKTOR BERUPA PLASMID
1. Memiliki origin of replication dari
inang yang dituju, sehingga
memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif:
Memudahkan seleksi sel pembawa
plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan
(multiple cloning sites, MCS)
MULTIPLE CLONING SITE (MCS)
Vektor berupa
Plasmid
VEKTOR BERUPA PLASMID
 Keunggulan:
 Kecil, mudah
pengerjaannya
 Strategi seleksi mudah
 Berguna untuk mengklon
potongan DNA ukuran kecil
(< 10kbp)
 Kelemahan:
 Kurang bermanfaat untuk
BAKTERIOFAGA ( L PHAGE)
VEKTOR BERUPA BAKTERIOFAGA ( L VECTORS)
 Lengan kiri:
 Protein penyusun
kepala & ekor
 Lengan kanan:
 Sintesis DNA

 Pengendalian
 Lisis inang

 Daerah yang
dihilangkan:
 integrasi & eksisi
 Pengendalian
Vektor berupa bakteriofaga
(l vectors)
VEKTOR BERUPA BAKTERIOFAGA
 Keunggulan:
 Bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA ukuran besar
(10 - 23 kbp)
 Seleksi berdasar ukuran

 Kelemahan:
 Lebih sulit pengerjaannya
VEKTOR COSMID
Gabungan sifat vektor plasmid dan
sifat berguna dari situs l cos
(dihilangkan pada vektor l)
 Keunggulan:
 Bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA berukuran sangat
besar (32 - 47 kbp)
 Seleksi berdasar ukuran
 Pengerjaan seperti plasmid
 Kelemahan:
 Tidak terlalu mudah untuk
mengerjakan plasmid dengan
ukuran sangat besar (~ 50 kbp)
Vektor
Cosmid
l ZAP
VEKTOR BAC

 Replikasi
dimediasi oriS
dan oriE
 parA and parB
mengendalikan
agar hanya
terdapat satu
vektor dalam sel
 Menggunakan
penanda
ketahanan
terhadap
R
VECKTOR YAC
large
inserts

ARS URA3 HIS3

telomere centromere markers telomere
replication
origin

 Dapat disisipi gen asing 200 -

2000 kbp dan dimasukkan ke
dalam yeast
 BACS DAN YACS

BACs : Bacterial Artificial

Chromosomes
 YACs : Yeast Artificial
Keunggulan:
Chromosomes
Dapat digunakan untuk mengklon
potongan DNA dengan ukuran sangat
besar (100 - 2,000 kbp)
 Penting digunakan dalam proyek
penetapan urutan basa nukleotida
total genom
 Kelemahan:
 Tidak mudah mengerjakan molekul
DNA dengan ukuran sangat besar
SHUTTLE VECTOR
 Vektor yang dapat digunakan untuk dua
macam inang (memiliki origin of replication
dari masing-masing inang)
MEMILIH VEKTOR

 Ukuran DNA yang

disisipkan
 Ukuran vektor
 Situs enzim restriksi
yang tersedia
 Jumlah salinan (copy
number)
 Efisiensi kloning
 Kemampuan untuk
menapis DNA sisipan
 Rencana penelitian
selanjutnya
TAHAPAN KLONING GEN
 Tahapan pokok kloning gen :
1 Identifikasi adanya pada sumber.
2. Isolasi dari gen lainnya
3. Rekombinasi, subkloning atau
ligasi dengan DNA/vektor plasmid
4. Transformasi ke E. coli.
5. Seleksi
6. Uji konfirmasi DNA Rekombinan
REKOMBINASI DNA DAN KLONING DNA
TAHAPAN KLONING GEN
1. Identifikasi adanya gen pada sumber (seleksi sumber
yang memiliki gen interes) dapat dilakukan pada tingkat
:
> DNA dg teknik PCR atau Shouthern Blot
> Produk ekspresi : mRNA dg Shouthern Blot, Protein
dg Western Blot, aktivitas enzim dan sifat teramati’
2. Isolasi dan (subkloning + transformasi) suatu gen dapat
dilakukan dg cara berbalikan :
> Dgn teknik PCR : isolasi dan subkloning +
transformasi
> Pustaka DNA (Genomik atau cDNA).Subkloning +
transformasi lalu isolasi
TAHAPAN KLONING GEN
Pustaka DNA  Kumpulan berbagai fragmen DNA (uk dan
sekuen bervariasi) yg berasal dari satu spesies atau
jaringan yg telah terklon
a. DNA Genomik (seluruh material genetik atau DNA)
b. cDNA (disintesis dari mRNA dg reverse transcriptase)
3. Seleksi dilakukan terhadap DNA rekombinan antara DNA
vektor dengan DNA sisipan (insert/gen) menggunakan :
a. Media tumbuh yang mengandung antibiotika tertentu
(sesuai dgn yg dibawa vektor)
b. Media tumbuh mengandung X Gal dan IPTG (Koloni biru
putih)
4. Uji konfirmasi : untuk memastikan bahwa klon yg terseleksi
membawa DNA rekombinan yg mgd gen interes, dgn
penentuan peta restriksi, PCR atau shouthern Blot
 CARA MENGKLON DNA (1) (REKOMBINASI DNA)
a. Isolasi vektor kloning
(plasmid bacterial) & DNA
sumber gen
b. Pemotongan DNA sumber
gen & vektor kloning
menggunakan enzim restriksi
yang sama
c. Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam vektor
kloning yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi
yang sama; potongan
disambung dengan bantuan
enzim DNA ligase
 CARA MENGKLON DNA (2)
d. Vektor kloning yang
telah tersisipi
potongan DNA
dimasukkan ke dalam
sel inang
(transformasi )
e. Penapisan sel
pengklon (dan gen
yang
dimasukkan)/seleksi
f. Identifikasi sel
pengklon pembawa
gen yang dikehendaki
TRANSFORMASI (1)

 Memasukkan plasmid (yang merupakan

vektor yang telah disisipi gen) ke dalam sel
inang (E. coli)

 PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid
dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida
(CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman
kepada bakteri yang mengakibatkan
membran sel dan dinding sel bakteri tersebut
menjadi permeabel terhadap plasmid donor.
Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi
“kompeten" untuk menerima plasmid .
TRANSFORMASI (2)

> INKUBASI
 Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E.
coli kompeten.
 Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak
ditambah plasmid digunakan sebagai

> KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)

Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun
kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) pada suhu 42
oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya

plasmid menembus membran dan dinding sel.

TRANSFORMASI (3)

 PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi
plasmid maupun kontrol)
ditumbuhkan dalam medium kaya
nutrisi untuk memberi kesempatan
penyembuhan setelah mengalami
cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung
satu waktu generasi (untuk E. coli
berkisar antara 30 hingga 45 menit)
TRANSFORMASI (4)

 PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah
mengalami penyembuhan ditapis
pada medium padat yang
mengandung senyawa penapis
berdasarkan penanda yang dibawa
oleh plasmid.
KOLONI E. COLI YANG MEMBAWA PLASMID DENGAN PENANDA GEN PENDAR FLUOR (PGLO)
E. COLI YANG MEMBAWA PLASMID PGLO
PENANDA SELEKTIF

Memudahkan seleksi sel pembawa

plasmid tersisipi DNA asing
 ketahanan terhadap antibiotik ganda
 penapisan biru-putih
 PENAPISAN KLON
> Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang
digunakan sebagai
penanda, misalnya
Kanamisin
> Bakteri ditaruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid
dengan penanda
ketahanan terhadap
Kanamisin(Kanr), yang
di sebelah kiri tidak
memilikinya
PENAPISAN WARNA KOLONI BIRU/PUTIH

lacZ lacZ insert

Enzim tidak
berfungsi
Enzim berfungsi X-gal produk

X-gal produ
k
PENAPISAN KOLONI BAKTERI PEMBAWA PLASMID REKOMBINAN

> seleksi biru

putih
Biru (koloni non
rekombinan)
Putih (koloni
rekombinan)
KLONING GEN X
> Bagaimanakah cara memperbanyak gen X
berukuran 3 kb bila tersedia vektor 5 kb
dan E coli?
> Gen X 3kb dan vektor dipotong dengan
enzim restriksi yang sama
> Vektor/plasmid diligasikan dengan gen X
menggunakan DNA ligase (pada suhu 4oC)
Terdapat dua kemungkinan,vektor
berligasi sendiri atau vektor berligasi
dengan gen X.
> Hasil ligasi ditransfer ke E. coli (setelah
dibuat kompeten) dengan heatshock pada
0
> Kemungkinan yang terjadi :
a. E. coli tidak kemasukan DNA manapun
b. E. coli kemasukan vektor/plasmid tidak mengandung
gen X
c. E. coli kemasukan vektor/plasmid mengandung gen X
> E. coli ditumbuhkan dalam media :
a. Media LA
b. Media LA dengan antibiotika
c. Media LA dengan antibiotika dan X-Gal dan IPTG
APA YANG TERJADI?
a. E coli tumbuh semua (jumlah banyak)
b. E coli yg kemasukan vektor saja yg hidup (putih)
c. E coli yg kemasukan vektor saja yg hidup yaitu
koloni biru non rekombinan dan putih rekombinan
(jumlah sama dengan media b)
UJI KONFIRMASI TERBENTUKNYA DNA REKOMBINAN
> E coli ditumbuhkan dalam media LB pada suhu 37oC
semalam.
Dilakukan isolasi DNA plasmid
DNA plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sama
pada saat rekombinasi DNA, dan dideteksi dengan
elektroforesis gel agarose.

> Profil elektroforesis DNA yang dihasilkan ?

a.DNA plasmid koloni biru tidak dipotong (1 pita 5 kb)
b. DNA plasmid koloni biru dipotong (1 pita 5 kb)
c. DNA plasmid koloni putih tidak dipotong (1 pita 8 kb)
d. DNA plasmid koloni putih dipotong (2 pita 1kb dan 5
kb)
 HIBRIDISASI KOLONI
 Dapat
dilakukan
jika
memiliki
DNA
pelacak
 Bagian
dari gen
yang
dikehenda
ki
 Bagian
dari gen