KLONING GEN

Defenisi klon
Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui
perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul
(contoh, DNA atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta
memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama
dengan molekul atau sel penurunnya
Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan memperbanyak suatu
potongan DNA tertentu (klon) yang dikehendaki dari campuran potonganpotongan DNA yang kompleks.
Tujuan mengklon Gen
Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut
Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali
gen tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang
mengakibatkan penyakit bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi
insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
Garis besar kloning gen
Membuka sel hidup, dengan cara memblender , skuensing dan destruksi (
memecah sel ).
Mengambil informasi genetik ( DNA ). Karena molekul DNA panjangnya
ratusan kali molekul lain didalam sel.
Memotong gen (DNA) khusus yang diinginkan menggunakan enzim
restriksi.
Menempatkan potongan DNA spesifik kedalam perantara yang disebut
cloning vehicles yang akan membawa DNA ke sel hidup yang lainnya.
Cloning vehicles adalah molekul DNA yang relatif pendek yang dapat
memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam sel.
Contoh tehnik rekombinan : pembuatan insulin dengan perantara
bakteri.
Insulin adalah hormon yang dibutuhkan untuk mengontrol metabolisme
gula dalam tubuh kita.
Pada penderita penyakit kencing manis (diabetict) terjadi kegagalan dalam
mensintesa hormon ini sehingga diperlukan penambahan insulin dari luar
untuk kelangsungan metabolisme gula dalam tubuh.
Perbanyakan DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)
Manfaat PCR

 Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpah
Kerjanya sangat spesifik dan ampuh.
Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi
Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami
kelainan sebelum dilahirkan.

Vektor untuk Mengklon

Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu
potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan
dan diperbanyak di dalam sel tersebut
1. Vektor berupa plasmid
a) Memiliki origin of replication dari inang yang dituju,
sehingga memungkinkan replikasi secara independen
terhadap genom inang.
b) Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel
pembawa plasmid tersisipi DNA asing
i. ketahanan terhadap antibiotik ganda
ii. penapisan biru-putih
c) Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple cloning sites,
MCS)
d) Mudah diisolasi dari sel inang.
Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui
perbanyakan bakteri
Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran kecil (<
10kbp)
Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran
besar (> 10kbp)
2. Vektor berupa bakteriofaga

a) Lengan kiri:
a. Protein penyusun kepala & ekor
b) Lengan kanan:
a. Sintesis DNA
b. Pengendalian
c. Lisis inang
c) Daerah yang dihilangkan:
a. integrasi & eksisi
b. Pengendalian
3. Cosmid
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs l cos
(dihilangkan pada vektor l)
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar
(32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan:
Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran
sangat besar (~ 50 kbp)
4. BACs (Bacterial Artificial Chromosome) & YAC (Yeast Artificial
Chromosome
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
Keunggulan:
Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran
sangat besar (100 - 2,000 kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida
total genom
Kelemahan:
Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat
besar
Cara Mengklon DNA
Isolasi vektor kloning (plasmid bacterial) & DNA sumber gen

Pemotongan DNA sumber gen & vektor kloning menggunakan

enzim restriksi yang sama
Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning
yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama;
potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase
Vektor kloning yang telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke
dalam sel inang (transformasi sel inang)
Penapisan sel pengklon (dan gen yang dimasukkan)
Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

transformasi sel inang

Memasukkan plasmid (yang merupakan vektor yang telah disisipi gen)
ke dalam sel inang
1. PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium
klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang
mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi
permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli
menjadi kompeten" untuk menerima plasmid
2. INKUBASI
Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E. coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid
digunakan sebagai control.
3. KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) dipaparkan
sejenak (90 detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini memaksimumkan
masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel.
4. PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) ditumbuhkan
dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan
setelah mengalami cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan biasanya
berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga
45 menit)
5. PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan ditapis pada medium
padat yang mengandung senyawa penapis berdasarkan penanda yang
dibawa oleh plasmid.
TINGKAT KEBERHASILAN KLONING :
Dipengaruhi oleh :

Pemilihan Vektor

Pemilihan sistem kloning, tergantung pada penentuan tujuan yang ingin

dicapai.
Tujuan dari kloning fragmen DNA