MUTASI, DNA

REPAIR DAN
REKOMBINASI
DNA
B Y I K A R A H AY U
SASARAN BELAJAR

1. Mahasiswa memahami arti mutasi, penyebab mutasi dan jenis

mutasi
2. Mahasiswa dapat membedakan mutasi gen, DNA dan kromosom
3. Mahasiswa memahami mekanisme DNA repair
4. Mahasiswa memahami teknologi rekombinan DNA
5. Mahasiswa memahami aplikasi teknologi rekombinan DNA di
bidang kesehatan
GARIS BESAR

1. Mutasi
2. DNA Repair
3. DNA Rekombinan
MUTASI

• Mutasi adalah perubahan materi genetik (gen atau

kromosom) suatu sel yang diwariskan kepada keturunannya.
• Tujuan mutasi adalah menghadapi perubahan alam yang
sewaktu-waktu akan timbul
PENYEBAB MUTASI
• Bahan-bahan yang menyebabkan terjadinya mutasi (mutagen) dibagi
menjadi 3
1. Mutagen bahan kimia, Contohnya adalah kolkisin dan zat digitonin
Mutagen kimiawi dapat dipilah menjadi 3 kelompok, yaitu analog
basa, agen pengubah basa, agen penyela.
2. Mutagen bahan fisika, Contoh mutagen bahan fisika adalah sinar
ultraviolet, sinar radioaktif, dan sinar gamma.
3. Mutagen bahan biologi, virus dan bakteri diperkirakan dapat
menyebabkan mutasi
 MUTASI Perubahan materi genetik (DNA) yang dapat
diwariskan secara genetis kepada
menghasilkan keturunannya

MUTAN

Mutasi
Pada sel kelamin
Berdasarkan sel Gametik
yang bermutasi
Mutasi Pada sel tubuh
Somatik
 Gross Pada struktur dan susunan
Berdasarkan kromosom
mutation
tempat terjadinya
mutasi Point Pada molekul susunan
mutation molekul
MUTASI GEN
• Mutasi gen pada dasarnya merupakan mutasi titik (point mutation)

• Terjadi perubahan kimiawi pada satu atau beberapa pasangan

basa dalam satu gen tunggal
• Perubahan urutan-urutan DNA atau mutasi titik merupakan
perubahan pada basa N dari DNA atau RNA
JENIS-JENIS MUTASI
1. Berdasarkan kejadiannya
a). Spontan (spontaneous mutation)
mutasi yang terjadi akibat adanya sesuatu pengaruh yang
tidak jelas, baik dari lingkungan luar maupun dari internal
organisme tsb
b). Induksi (induced mutation)
mutasi yang terjadi akibat paparan dari sesuatu yang
jelas
• Berdasarkan jenis sel yang bermutasi
a) Mutasi somatik
mutasi yang terjadi pada sel-sel somatik
a) Mutasi gametik germinal
mutasi yang terjadi pada sel gamet
1. Mutasi gen, mutasi yang terjadi dalam lingkup gen
a). Mutasi salah arti (missense mutation)
perubahan suatu kode genetik (umumnya pada posisi 1 dan 2
pada kodon) yang menyebabkan asam amino yang terkait
pada rantai polipeptida berubah. Jenis mutasi ini disebabkan
oleh peristiwa transisi dan tranversi.
b). Mutasi diam (silent mutation)
perubahan suatu pasangan basa dalam gen (pada posisi 3
kodon) yang menimbulkan perubahan satu kode genetik tetapi
tidak mengakibatkan perubahan atau pergantian asam amino
yang dikode. Dapat juga disebabkan oleh transisi dan
tranversi.
c) Mutasi tanpa arti (nonsense mutation)
perubahan kodon asam amino tertentu menjadi kodon
stop
d) Mutasi Pergeseran Kerangka/perubahan rangka baca
(frameshift mutation)
mutasi yang terjadi karena delesi atau insersi satu atau
lebih pasang basa dalam satu gen sehingga ribosom
membaca kodon tidak lengkap. Dapat terjadi akibat
peristiwa tranversi, transisi, insersi dan delesi.
MUTASI GEN — Transisi dan Transversi
MUTASI GEN — Substitusi

Mutasi Diam
MUTASI GEN — Insersi dan Delesi

Delesi menyebabkan mutasi salah arti

MUTASI GEN — Insersi dan Delesi
Insersi
menyebabkan
mutasi tanpa
arti

Delesi tiga
nukleotida
menyebabkan
mutasi salah
arti
MUTASI GEN — Substitusi

Mutasi Salah
Arti

Mutasi Tanpa
Arti
MUTASI GEN — Frameshift
Contoh mutasi gen pada manusia yang mengakibatkan kelainan sickle-cell anemia.

1. Molekul DNA mengalami mutasi berupa penggantian

basa timin dengan adenin pada rantai nukleotida.

2. mRNA menghasilkan triplet kodon GUA.

3. Asam amino yang dihasilkan

berupa valin.
3. Mutasi kromosom
Mutasi biasanya digunakan untuk perubahan gen, sedangkan untuk
perubahan kromosom yang dapat diamati dikenal sebagai variasi
kromosom/aberasi.

Mutasi kromosom yaitu mutasi yang disebabkan karena perubahan

struktur kromosom atau perubahan jumlah kromosom
a). Mutasi Komosom Akibat Perubahan Jumlah Kromosom
b). Mutasi Kromosom Akibat Perubahan Struktur Kromosom
MUTASI KROMOSOM
Perubahan struktur kromosom
Perubahan jumlah kromosom

Euploid Variasi dalam sejumlah set dasar kromosom

(genom).

Autopoliploid Kelipatan jumlah kromosom yang berasal dari

genom spesies yang sama.

Alopoliploid Kelipatan jumlah kromosom yang berasal dari

genom spesies yang berbeda.

Aneuploid Variasi jumlah kromosom yang diakibatkan

adanya pengurangan atau penambahan satu
atau sejumlah kecil kromosom akibat gagal
berpisah.
Aneuploid

Gagal berpisah saat meiosis I Gagal berpisah saat meiosis II

Kelainan-kelainan pada manusia yang disebabkan oleh
perubahan kromosom

Sindrom Down Trisomi 21 sehingga memiliki 47 kromosom

Sindrom Klinefelter Tambahan kromosom X pada anak laki-laki

menghasilkan XXY
Sindrom Turner Monosomi X pada anak perempuan menghasilkan
XO
Kromosom ekstra Y (XYY)

Trisomi X (XXX)

Sindrom Cri du chat Delesi kromosom nomor 5

Sindrom Down

Anak penderita sindrom Down.

Kurva hubungan antara umur ibu

Kariotipe sindrom Down menunjukkan trisomi 21. sewaktu melahirkan dengan
dilahirkannya anak sindrom Down.
Sindrom Cri du chat

(a) Bayi laki-laki dengan sindrom Cri du chat. (b) Anak laki-
laki yang sama setelah berumur 4 tahun.
DNA REPAIR
• DNA repair merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang
mengalami kerusakan / kesalahan yang diakibatkan oleh proses
metabolisme yang tidak normal, radiasi dengan sinar UV, radiasi ion,
radiasi dengan bahan kimia, atau karena adanya kesalahan dalam
replikasi DNA.
• DNA merupakan sasaran untuk berbagai kerusakan: baik eksternal
agent maupun secara spontan.
Pada fase G1 (Gap 1) terdapat check point yaitu suatu tempat
dimana susunan DNA akan dikoreksi dengan seteliti-telitinya.
Apabila ada kesalahan / kerusakan DNA
Maka sel mempunyai dua pilihan, yaitu:
1. Kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA
repair
2. Apabila DNA tidak mampu diperbaiki lagi, DNA akan dimatikan
supaya tidak memberi pengaruh buruk terhadap lingkungan
sekelilingnya. Kemudian sel dengan DNA yang normal akan
meneruskan perjalanan untuk melengkapi siklus yang tersisa yaitu S
(sintesis) G2 (Gap 2) dan M (Mitosis)
MEKANISME DNA REPAIR
A. Single strand
1. Base excision
2. Nucleotide excision
3. Mismatch repair

B. Double strand
1. Non homologous end joining
2. Homologous recombination
Komponen yang terlibat dalam DNA repair
 BASE EXCISION REPAIR (PEMOTONGAN BASA)

• Basa-basa DNA dapat dirusak melalui deaminasi atau alkilasi

• Tempat kerusakan basa tsb disebut "abasic site" atau "AP site".
• Enzim DNA glycosylase dapat mengenal AP site dan membuang
basa dengan memisahkan ikatan glikosidik antara basa dan
gula
• Kemudian AP endonuclease membuang AP site dan nucleotida
sekitarnya, celah diperbesar oleh fosfodiesterase
• Dengan bantuan DNA polymerase strand ditutup dan dilekatkan
oleh DNA ligase
 NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR
(PEMOTONGAN NUKLEOTIDA)

• Adalah memotong pada bagian strand DNA yang mengalami “bulky lesion”
pada nukleotida/pirimidin dimer
• Proses dimulai oleh enzim endonuclease, dengan membuat incise pada
backbone strand di dua sisi lesi
• Oligonukleotida yang rusak ditahan dalam dupleks dengan ikatan hydrogen
pada basa dari strand lainnya
• Selama replikasi, DNA dipisahkan oleh DNA helicase
• Setelah dipotong dan dibuang, maka celah diisi oleh DNA polymerase dan
strand yang direpair dilekatkan oleh DNA ligase
PIRIMIDIN DIMER
 NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR
(PEMOTONGAN NUKLEOTIDA)

• Pada E. Coli terdapat enzim endonuklease (UVrA, UVrB,

UVrC) yang terlibat dalam proses pembuangan atau
pemotongan DNA tsb
• Nukleotida yang rusak tsb dihilangkan sehingga terjadi
kekosongan pada segmen untaian nukleotida tsb
• DNA polymerase I mensintesis nukleotida yang baru dan DNA
ligase berperan dalam penyambungan segmen DNA tsb
MISMATCH REPAIR
(PERBAIKAN YANG TIDAK BERPASANGAN)

• Pada tahap ini dilakukan perbaikan kesalahan-kesalahan yang

terjadi ketika DNA disalin.
• Polimerase ini mengoreksi setiap nukleotida terhadap
cetakannya begitu nukleotida ditambahkan pada untaian.
• Dalam rangka mencari nukleotida yang pasangannya tidak
benar, polymerase memindahkan nukleotida tersebut
kemudian melanjutkan kembali sintesis,
• Pasangan basa mismatch menyebabkan distorsi dalam bentuk
double helix yang timbul pada kesalahan replikasi.
• Pada E.coli, basa mismatch direpair oleh enzim :
a. Mut S, mengenali lesi dan mengawali penyusunan kompleks
repair
b. Mut L, memotong pada sekuens GATC pada rantai
unmethylated
c. Mut H, memindahkan bagian DNA yang mengandung GATC
site/mismatch
• Celah pada rantai tunggal diisi oleh DNA polymerase III
 DOUBLE STRAND BREAK REPAIR
• Kerusakan pada untai ganda ini terjadi ketika dua untai ini
putus, berbahaya karena dapat menyebabkan penyusunan ulang
genom
• Irreparable
• Mekanisme:
Non homologous end joining, Homologous recombination
PENYAKIT AKIBAT DEFEK PADA DNA REPAIR
REKOMBINAN DNA
PENDAHULUAN
 Teknologi rekombinan DNA merupakan teknik atau metode yang
digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen dalam tabung reaksi,
gen berasal dari sumber yang berbeda
 Teknologi rekombinan DNA meliputi:
– Teknik pemotongan DNA (donor dan vektor)
– Teknik pembentukan DNA rekombinan
– Teknik Kloning DNA rekombinan
– Teknik penapisan hasil kloning DNA
 Dalam bioteknologi, manusia berusaha menanipulasi atau
memodifikasi organisme atau komponen organisme supaya
menghasilkan produk yang diinginkan/bermanfaat.
 Salah satu bentuk manipulasi tersebut terjadi melalui perubahan
informasi genetik (DNA) suatu organisme melalui Rekayasa Genetik.
 Rekayasa genetik menggunakan teknologi DNA rekombinan
TAHAP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
DNA yang akan
di’klon’
+
Plasmid
DNA
(vektor)
rekombinan

Penumbuhan
Sel inang
Membawa klon

Sel Inang
Materi penting yang digunakan dalam rekombinan DNA
1. DNA
2. Enzim restriksi
3. Vektor
 PEMOTONGAN DNA
• Pemotongan DNA (sumber dan vektor) dilakukan dengan
bantuan enzim restriksi endonuklease.
• Enzim restriksi:
–Berperan sebagai gunting molekuler yang memotong pada
titik tertentu (situs pengenalan/ recognition site):
• Berupa 4-8 pb dan bersifat palindom (Urutan basa yang
identik ketika dibaca dari arah 5-3 dan 3-5)
–Memutuskan ikatan fosfodiester melalui hidrolisis
URUTAN BASA PALINDROM
 AKTIVITAS ENZIM RESTRIKSI
Scanning

GGACGCTAGCTGATGAATTCGCATCGGATCCGAATCCGCTCTTTCAA
CCTGCGATCGACTACTTAAGCGTAGCCTAGGCTTAGGCGAGAAAGTT

Recognition Sequence

GGACGCTAGCTGATGAATTCGCATCGGATCCGAATCCGCTCTTTCAA
CCTGCGATCGACTACTTAAGCGTAGCCTAGGCTTAGGCGAGAAAGTT

Cleavage
GGACGCTAGCTGATG AATTCGCATCGGATCCGAATCCGCTCTTTCAA
CCTGCGATCGACTACTTAA GCGTAGCCTAGGCTTAGGCGAGAAAGTT
• Penamaan Enzim Restriksi:
–EcoRI
• E = genus (Escherichia) • co = species (coli)
• R = strain • I = # of enzyme

• Enzim restriksi akan menghasilkan dua pola potongan:

–Ujung tumpul (blunt)
–Ujung lengket (overhang atau sticky)
• Enzim restriksi yang berbeda akan menghasilkan pola
potongan yang berbeda pula
 ENZIM RESTRIKSI

• Enzim restriksi: memotong DNA pada

daerah spesifik
• Memotong daerah/urutan palindrome
sequences, yaitu daerah yang memiliki
two-fold symmetry
• Krusial pada penelitian DNA, untuk
sekuensing, hibridisasi
• Companies purify and market restriction
enzymes
5’ OVERHANGS
• 5' overhangs: The enzyme cuts asymmetrically within the recognition site such that a
short single-stranded segment extends from the 5' ends.
• misal: BamHI
3’ OVERHANGS
 3' overhangs: asymmetrical cutting within the recognition site, but the result
is a single-stranded overhang from the two 3' ends
 contoh: KpnI
BLUNT ENDS
Blunt: Enzymes that cut at precisely opposite sites in the two
strands of DNA generate blunt ends without overhangs
contoh: SmaI
ENZIM RESTRIKSI
JENIS-JENIS ENZIM RESTRIKSI
– Vektor:
• Merupakan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke
dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel
tersebut
• Memiliki situs pengenalan bagi enzim restriksi; dapat
bereplikasi/memperbanyak diri pada sel inang; dapat memuat gen yang
akan dimasukan; mengandung pananda selektif (selectable marker)
• Berupa:
– plasmid (umum);
– bakteriofage;
– kosmid;
– BACs (Bacterial Artificial Chromosome); dan
– YACs (Yeast Artificial Chromosome)
 TEKNIK PEMBENTUKAN DNA
REKOMBINAN
• DNA donor maupun vektor yang telah dipotong dengan enzim
restriksi yang sama akan saling berhibridisasi (perpasangan basa-
basa komplementer) melalui pembentukan ikatan-H pada ujung-
ujungnya (sticky ends)
• Enzim Ligase membentuk ikatan fosfodiester antar DNA donor dan
vektor
– Terbentuk DNA rekombinan
HIBRIDISASI DAN LIGASI DNA
REKOMBINAN
TEKNIK PEMBENTUKAN DNA REKOMBINAN
TEKNIK KLONING DNA REKOMBINAN

• DNA rekombinan yang telah terbentuk selanjutnya diintroduksikan ke

dalam sel inang melalui proses transformasi
• Sel inang yang digunakan umumnya berupa sel bakteri (E.coli):
– Informasi genetiknya sudah sangat dipahami
– Tumbuh cepat dan tidak banyak persyaratan
– Dapat menerima berbagai vektor, mudah ditransformasi
 TEKNIK PENAPISAN HASIL CLONING
DNA
• Penapisan dilakukan dengan menumbuhkan bakteri inang
pada media selektif
–Mengandung antibiotik:
–Mengandung senyawa tertentu: X-gal
• Bakteri inang yang membawa plasmid rekombinan akan
resisten terhadap antibiotik dan tidak mampu mengubah
memecah X-gal (koloni berwarna putih)
TEKNIK PENAPISAN HASIL KLONING DNA
SELEKSI GEN YANG DIKLONING
• Bakteri inang yang membawa plasmid rekombinan (berisi
gen yang diinginkan maupun potongan gen yang tidak
diinginkan) harus diseleksi
• Dilakukan dengan cara hibridisasi asam nukleat dengan
menggunakan suatu penanda (probe)
–Probe asam nukleat diberi label radio isotop sehingga
pada saat penelusurun dapat dilihat DNA klon yang
komlementr dengan DNA probe yang berikatan
hidrogen secara spesifik.
 Hybridization with a complementary nucleic acid probe detects a specific DNA within a mixture of DNA
APPLICATION molecules. In this example, a collection of bacterial clones (colonies) are screened to identify those
carrying a plasmid with a gene of interest.

Cells from each colony known to contain recombinant plasmids (white colonies in Figure 20.4, stap 5) are
TECHNIQUE transferred to separate locations on a new agar plate and allowed to grow into visible colonies. This
collection of bacterial colonies is the master plate.

Colonies
Master plate Master plate
containing
Probe gene of
Solution DNA
Radioactive interest
containing Gene of
single-stranded
probe interest
DNA

Single-stranded Film
Filter DNA from cell
Filter lifted and
flipped over
Hybridization
on filter

Colonies of cells containing the gene of interest have been identified by nucleic acid hybridization. Cells from
RESULTS
colonies tagged with the probe can be grown in large tanks of liquid growth medium. Large amounts of the DNA
containing the gene of interest can be isolated from these cultures. By using probes with different nucleotide
sequences, the collection of bacterial clones can be screened for different genes.
APLIKASI TEKNOLOGI REKOMBINAN
DNA
• Manfaat teknologi DNA rekombinan
– Dalam Bidang Kedokteran:
• Produksi Insulin
– Dalam bidang hukum:
• Analisis sidik jari DNA
 Bacterium Cell containing gene
of interest

Plasmid Gene of
Bacterial
chromosome interest
DNA of
Recombinant
chromosome
DNA (plasmid)

Recombinate
bacterium
3

Gene of
interest Protein expressed
by gene of interest
Copies of gene Protein harvested

Basic Basic
research research
on gene on protein

Gene for pest Gene used to alter Protein dissolves Human growth
resistance inserted bacteria for cleaning blood clots in heart hormone treats
into plants up toxic waste attack therapy stunted growth
PRODUKSI INSULIN
PRODUKSI INSULIN
SIDIK JARI ATAU FORENSIK DNA
• Dilakukan dengan menganalisis Variable Number Tandem Repeats (
VNTRs), yaitu intron (daerah bukan pengkode) yang tersusun atas utasan
berulang 20-100 bp pada DNA
– Pola ulangan yang bersifat unik antar indidividu sehingga dapat
menjadi “sidik jari”
– Memanfaatkan teknik Elektroforesis gel dan Southern blotting of DNA
fragments.
– VNTRs seseorang berasal dari informasi genetik yang diwariskan oleh
kedua orang tuanya ( ibu dan/atau ayah).
GEL ELEKTROFORESIS
SOUTHERN BLOTTING OF DNA FRAGMENTS
Researchers can detect specific nucleotide sequences within a DNA sample with this method. In particular,
APPLICATION Southern blotting is useful for comparing the restriction fragments produced from different samples of
genomic DNA.
In this example, we compare genomic DNA samples from three individuals: a homozygote
TECHNIQUE
for the normal -globin allele (I), a homozygote for the mutant sickle-cell allele (II), and a
heterozygote (III).

Heavy
DNA + restriction enzyme Restriction Nitrocellulose weight
fragments I II III paper (blot)

Gel

Sponge

Samplae III Alkaline

Sample I Sample II solution Paper
towels

Preparation of restriction fragments. Gel electrophoresis. Blotting.

SOUTHERN BLOTTING OF DNA FRAGMENTS

Probe hydrogen-
bonds to fragments
I II III
I II III

Radioactively
labeled probe for
VNTR Fragment from
Film over
Sampe-probe
paper blot

Fragment from
Paper blot Sampe-probe
1 Hybridization with radioactive probe. 2 Autoradiography.
 SIDIK JARI ATAU FORENSIK DNA
• Aplikasi:
– Penentuan ke-bapak-an dan ke-ibu-an ( Paternity and Maternity)
• karena seseorang mewarisi VNTRS dari orang tuanya, maka pola VNTRs dapat
digunakan untuk menentukan ke-bapak-an dan ke-ibu-an.
– Identifikasi Penjahat dan Forensik
• DNA yang diisolasi dari darah, air mani (semen), rambut, sel-sel kulit, atau
barang bukti genetik lainnya yang ditemukan di tempat kejadian perkara
dibandingkan (melalui pola VNTR) dengan DNA dari tersangka pelaku kejahatan,
untuk menentukan bersalah atau tidaknya si tersangka tersebut.
• Pola VNTR juga berguna dalam menetapkan identitas dari korban pembunuhan,
juga dari DNA yang ditemukan sebagai barang bukti atau dari mayat itu sendiri.
PATERNITY AND MATERNITY TEST
• In this example, a family
consists of a mom and dad, two
daughters and two sons.
• The parents have one daughter
and one son together, one
daughter is from the mother’s
previous marriage, and one son
is adopted, sharing no genetic
material with either parent.
• daughter 2 is the child
from the mother’s previous
marriage and son 2 is
adopted.
• daughter 1 and son 1 are
the children from current
marriage
PATERNITY AND MATERNITY TEST
• DNA samples were taken from a crime scene,
the female victim and two suspects in a
sexual assault case.
• The victim’s boyfriend was also tested. The
DNA ladders are used to judge the sizes of
the DNA fragments.
• Control samples are also run, to ensure that
the experiment is done correctly.
• Can you determine which suspect is likely the
criminal?
• The DNA fingerprint from suspect 1
matches up with the fingerprint of the
sperm DNA from the crime scene. You
can also see that the female cells from
the scene match the victim’s DNA.