Ubur-Ubur Berpendar

(Aequorea victoria )

TEKNOLOGI
DNA REKOMBINAN
 PENGERTIAN

Teknologi DNA rekombinan atau sering juga disebut rekayasa

genetika merupakan teknologi yang memanfaatkan proses
replikasi, transkripsi, dan translasi untuk memanipulasi,
mengisolasi dan mengekspresikan suatu gen dalam organisme
yang berbeda.

DASAR TDR

Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme

yang terdapat pada bakteri. Hasil Percobaan Lederberg dan
Tatum (1946) menunjukkan bahwa bakteri mempunyai
mekanisme seksual.
Percobaan Lederberg
dan Tatum (1946)
PERANGKAT TDR

Transposon
alat untuk mutagenesis dan
Perangkat yang digunakan menyisipkan penanda
dalam teknologi DNA
rekombinan antara lain: Pustaka genom
1. Enzim restriksi  menyimpan gen atau fragmen
DNA yang telah diklonkan.
2. Enzim DNA ligase
Fragmen DNA/gen disimpan
3. Vektor (plasmid) untuk sementara waktu di dalam
4. Transposon pustaka plasmid atau pustaka
5. Pustaka genom fage.
6. Enzim transkripsi balik
Enzim traskripsi balik
7. Pelacak DNA/RNA
 membuat DNA berdasarkan
RNA.
 TAHAP TDR

Cakupan teknik dalam teknologi DNA rekombinan antara

lain sebagai berikut:
 Teknik untuk mengisolasi DNA
 Teknik untuk memotong DNA
 Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA
 Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup
sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat
diekspresikan.
 Teknik kloning sel
 Teknik seleksi rekombinan
 ISOLASI DNA

Isolasi DNA Plasmid

 Teknik sentrifugasi gradient
densitas etidium bromida sesium
Isolasi DNA Kromosom
klorida yang berkecepatan tinggi
1. Kultivasi sel dalam media yang
 DNA plasmid membentuk pita
sesuai
terpisah dengan pita genom
2. Pemecahan dinding sel  secara
 Pita DNA dalam tabung terlihat
fisik (sonikasi) & kimiawi (lisozim,
melalui pendaran etidium
EDTA, deterjen triton X-100,
bromida yang disinari UV
SDS)
 DNA plasmid diambil dengan
3. Ekstraksi DNA genom 
menusukkan jarum suntik pada
sentrifugasi
dinding tabung dimana pita
4. Purifikasi DNA
DNA plasmid terlihat dan
fenol&kloroform sentrifugasi
menyedotnya.
 Rnase  presipitasi etanol
 Etidium bromida yang terikat
(20ºC)  sentrifugasi
pada DNA plasmid diekstraksi
dengan n-butanol, dan CsCl
dihilangkan dengan cara dialisis.
Enzim Restriksi
Enzim Ligase Plasmid

Pustaka Genom
MENYAMBUNG DNA

Menyambung merupakan proses penempelan DNA interest dengan vektor

kloning. Sehingga yang dibutuhkan adalah DNA interest dan vektor kloning.
 Vektor yang dapat digunakan
pada sel inang prokariot,
khususnya E.coli, adalah
plasmid, bakteriofag, kosmid
dan fosmid.
DNA interest bisa diperoleh dengan  Vektor YACs dan YEps
dua cara, yaitu: digunakan pada khamir.
1. Produk PCR  Plasmid Ti, baculovirus, SV40
2. Fragmen DNA hasil dan retrovirus merupakan
pemotongan dengan enzim vektor yang digunakan pada sel
restriksi eukariot tingkat tinggi.
 DNA plasmid heliks ganda
sirkuler yang dapat bereplikasi
secara otonom, karena memiliki
titik awal replikasi (origin of
replication = ORI) sendiri.
TAHAP TDR

DNA yang akan

di’klon’
+
Plasmid DNA
(vektor) rekombinan

Penumbuhan
Sel inang
Membawa klon

Sel Inang
Struktur Plasmid
MENYAMBUNG DNA

 Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim

restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel
(dapat diligasi).
 Ada tiga cara meligasi fragmen DNA secara in vitro:
1. Lligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri (hanya untuk
ujung lengket).
2.Lligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi
dengan bakteriofag T4 (enzim T4 ligase) (baik pada ujung lengket dan
tumpul).
3.Pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai
tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan
diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi
menggunakan DNA ligase.
 Dilakukan pada suhu 4-15°C dengan waktu inkubasi semalam.
MENYAMBUNG DNA

Pada reaksi ligasi fragmen DNA genomik dan DNA vektor, dapat terjadi
peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan
dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali 
menurunkan efisiensi ligasi  pemberian perlakuan:
 penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100Ng/ml),
 perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus
fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong,
 pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal
homopolimerik 3’
MENYAMBUNG DNA

 kedua ujung DNA berpasangan, kemudian enzim ligase dapat membentuk

ikatan fosfodiester antara kedua molekul DNA.
 Reaksi enzimatik ini memerlukan energi dari ATP.
MENYAMBUNG
DNA
MENYAMBUNG
DNA

 Rekombinasi dua fragmen DNA berujung lancip dapat menggunakan fragmen

EcoRI. Rekombinasi dua fragmen DNA berujung tumpul dapat menggunakan
fragmen SmaI.
MENYAMBUNG
DNA

 Ikatan Fosfodiester dari penggunaan enzim T4 DNA Ligase

TRANSFER DNA

 Beberapa spesies bakteri yang sering digunakan dalam industri

bioteknologi antara lain adalah Bacillus subtilis, Eschericia coli,
Saccharomyces cerevisiae (Radji, M., 2011).
 Untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri, sel tersebut harus diberi
perlakukan agar menjadi sel kompeten, yaitu sel yang mampu
menerima DNA dari luar.
 Kemampuan paling tinggi untuk memasukkan DNA dari luar terjadi
pada sel yang berada dalam fase logaritmik, yaitu pada waktu
pertumbuhan sel sedang cepat.
 Proses transfer DNA rekombinan ke dalam sel hospes tergantung pada
jenis vektor yang digunakan. Beberapa cara transfer:
1. Transformasi
2. Transfeksi
3. Mikroinjeksi
4. Mikroprojektil
TRANSFER DNA
Transformasi
 vektor: plasmid DNA.
 DNA rekombinan dapat
ditransformasikan ke dalam sel
inang dengan cara:
1. Induksi Kimia  heat shock
dengan CaCl2 suhu 42°C 90
detik
2. Elektroporasi 
meningkatkan permeabilitas
dinding sel dengan
menempatkan sel pada
medan listrik yang kuat.
3. Konjugasi  terjadi secara
alamiah diantara sel bakteri
melalui pili bakteri. Ex:
plasmid Ti
Transfeksi
 vektor: virus bakteriofag.
 DNA rekombinan yang akan
ditransfer dikemas terlebih
dahulu dalam kapsid
bakteriofag, kemudian
diinfeksikan kedalam sel
penerima.
 Proses transfer DNA melalui
transfeksi ini menyerupai proses
infeksi oleh virus yang terjadi
secara alamiah.
 Replikasi dan propagasi akan
meningkatkan jumlah DNA
rekombinan
TRANSFER DNA

Mikroinjeksi
Mikroprojektil
 mentransfer DNA secara
 untuk mentransfer DNA
langsung kedalam sel
kedalam sel atau jaringan
menggunakan jarum suntik
tanaman.
mikro
 Partikel DNA ditembakkan
 mentransfer DNA kedalam sel
langsung dengan suatu alat
hewan atau sel tanaman,
penembak khusus langsung
karena sel tersebut berukuran
kedalam sel tanaman.
relative lebih besar daripada sel
 berbagai jenis alat penembak
bakteri.
gen, salah satu jenisnya antara
 DNA rekombinan yang akan
lain adalah pistol penembak
ditransfer diinjeksikan lengsung
gen.
kedalam nucleus sel penerima.
 KULTUR SEL

 Sel diisolasi  dimasukkan kedalam tabung kultur yang mengandung

medium perbenihan cair yang sesuai  sel akan tumbuh  DIHASILKAN
DNA Rekombinan dalam jumlah banyak.
SELEKSI KLON REKOMBINAN

 klon-klon perlu dipilih untuk menentukan mana koloni bakteri yang

membawa plasmid rekombinan
 Terdapat beberapa cara seleksi klon rekombinan, diantaranya:
1. Seleksi berdasarkan sifat resistan terhadap antibiotik.
Pada seleksi ini plasmid yang digunakan mempunyai dua gen resistan
terhadap antibiotik. Misalnya gen Ampr (gen resistan ampisilin dan
gen Tetr (gen resistan terhadap tetraciclin). Penyisipan DNA asing
dilakukan di dalam gen Tetr, sehingga bila mengandung sisipan DNA
asing gen Tetr tidak akan aktif. Bakteri transforman pertama
ditumbuhkan pada media yang mengandung Ampicilin, sehingga
koloni yang tumbuh adalah koloni yang membawa plasmid.
Kemudian koloni-koloni ini dipindahkan ke media yang mengandung
tetrasiklin, sehingga koloni yang mengandung DNA sisipan (dimana
gen Tetr-nya sudah tidak aktif) tidak akan tumbuh. Maka kita akan
tahu koloni mana yang mengandung DNA sisipan.
SELEKSI KLON REKOMBINAN

2. Seleksi dengan melibatkan gen LacZ.

Plasmid yang digunakan mempunyai gen Ampr dan gen LacZ. Gen LacZ
mengkode enzim β-galaktosidase yang mengkatalisis pemecahan laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa.
Penyisipan DNA (gene of interest) dilakukan di dalam gen LacZ ini,
sehingga bila mengandung DNA sisipan maka gen LacZ akan inaktif.
Seleksi dilakukan dengan menambahkan substrat analog laktosa yaitu X-
gal yang akan dipecah oleh enzim β-galakotosidase menjadi senyawa
yang berwarna biru (5-bromo-4 kloro-3-indigo). IPTG (isopropil
tiogalaktopiranosida) digunakan sebagai inducer.
Bakteri transforman ditumbuhkan pada media yang mengandung
Ampicilin, X-gal dan IPTG. koloni yang tumbuh adalah koloni yang
membawa plasmid.
Akan tetapi terdapat dua jenis koloni, yaitu yang berwarna putih dan
biru. Koloni yang berwarna biru menandakan terdapat senyawa 5-
bromo-4 kloro-3-indigo (hasil penguraian X-gal oleh β-galaktosidase),
artinya gen LacZnya aktif sehingga tidak ada DNA sisipan. Sedangkan
koloni yang berwarna putih, adalah koloni yang tidak menghasilkan
senyawa berwarna, gen LacZ inaktif dan mengandung DNA sisipan.
 APLIKASI TDR

Beberapa aplikasi dari teknologi DNA rekombinan antara lain pada bidang
penelitian dasar berupa penentuan urutan dan letak DNA, proyek “human
genom”, keperluan forensik, bidang medik berupa penentuan penyakit
tertentu dan pemenuhan kebutuhan farmasi seperti vaksin, bidang
lingkungan berupa penanganan limbah, bidang peternakan berupa hewan
transgenik, dan bidang pertanian berupa tanaman transgenik.
Human Genome
Produk Farmasi
Vaksin
Insulin
DNA Fingerprinting
Using DNA Fingerprints to Identify Individuals & Genes

DNA Fingerprints
Bidang Lingkungan
Bidang Pertanian
Bidang Peternakan
 PHYSIOLOGY METHODOLOGY
• Why do we clone
proteins and
receptors
 provide structural
information, can be used
to synthesize small
peptides
 production of hormones
by recombinant DNA
techniques
PHYSIOLOGY METHODOLOGY