Teknologi

DNA
Rekombinan
By: Hanifah Majlaini (8226174010)

PROGRAM MAGISTER PENDIDIKAN BIOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA (SPs) UNIVERSITAS
NEGERI MEDAN
2023
 Outline

Prinsip Dasar Teknologi DNA

01 Rekombinan

02 Tahapan DNA Rekombinan

03 Manfaat dan Dampak DNA Rekombinan

 Overview
• DNA rekombinan adalah Molekul DNA baru yang terbentuk dengan cara memasukkan
sekuen DNA dari suatu organisme ke dalam vektor

• Teknologi yang digunakan untuk menghasilkan DNA rekombinan disebut teknologi

DNA rekombinan
 
01
Prinsip Dasar
Teknologi DNA
Rekombinan
 Prinsip Dasar Rekombinasi DNA

Penyediaan DNA (Sisipan Ligase (Vector Seleksi (Sel yang mengandung

dan Vektor) Recombinan) plasmid/Vektor rekombinan

1 3 5
2 4 6

Enzim Restriksi Transformasi DNA Deteksi (Keberadaan

(transfer informasi dan Kebenaran DNA
genetik sel inang dan sisipan)
perbanyakan DNA
 Penyediaan DNA (Sisipan dan Vektor)
2. Mendorong transkripsi gen
5. Memungkinkan eksperimen untuk
target
mengidentifikasi sel sel bakteri dengan
membedakan antara sel inang yang
menangdyng plasmid atau tidak dengan
memberikar bakteri tekanan utk menjaga
plasmid

1. Lokasi spesifik di untai

DNA dimana replikasi 3. Situs pemotongan enzim
dimulai endonucluase
4. Mendeteksi bakteri yang
mengandung plasmid, sebagai
pendanda seleksi hasil 6. Insersi gen, promotor atau
transformasi DNA fragmen yang akan
dicloning (Casali and Preston,
2003)
Enzim Retriksi
● Enzim restriksi /restriksi endonuklease (endo, "di dalam"; nuklease, "Enzim pemecah asam
nukleat") memotong sekuens DNA yang bertentangan dengan enzim yang memotong dari ujung
sekuens DNA (exonucleases).
● Enzim restriksi memotong DNA dengan memotong ikatan fosfodiester (dalam tulang punggung
gula-fosfat) yang bergabung dengan nukleotida yang berdekatan dalam untai DNA. Namun, enzim
restriksi tidak hanya memotong DNA secara acak, juga tidak semua enzim restriksi memotong DNA
di lokasi yang sama
Prinsip kerja enzim restriksi adalah:
● Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuclease restriksi.
● Enzim pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut
● Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya bila kedua
utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang
sama pula nukleotidanya
● Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif (sticky end) dan
ujung rata (blunt end) (Nughroho dan Rahayu, 2018).
Enzim Ligase
Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan DNA.
Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari
Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut:
1. Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang terpotong
2. Penyambungan dilakukan dengan cara menyambungkan 2 ujung DNA melalui ikatan
kovalen antara ujung 3'OH dari utas satu dengan ujung 5'P dari utas yang lain
3. Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA
sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu
(Nughroho dan Rahayu, 2018).
( Thieman and Palladino., 2013).
 TAHAPAN DNA REKOMBINAN
1. Isolasi DNA
LISIS Ekstraksi Presipitasi Washing Elusition

1.1. LISIS

• Memecah sel dan mengeluarkan DNA dari nukleus

Fisika

Kimia Detergen+ Pelarut Organik

• sodium Dodecely Sulfate (SDS)
• Laury Sulfate
• Kloroform

Enzim -> menargetkan ikatan asam amino

• Proteinase K : Sel hewan
• Selilasi : sel tumbuhan
• Litikasi : yeast
• Lisosim : bakteri gram positif
 TAHAPAN DNA REKOMBINAN
1.2. Ekstraksi
֎ Setelah proses lisis banyak komponen seluler yang terekstrak dari dalam sel sehingga untuk menghilangkan
komponen lain yang tidak diinginkan
֎ Menambahkan protease (mendegradasi protein) dan Rnase sehingga yang tertinggal hanya DNA

1.3. Persipitasi

֎ Pengendapan larutan DNA

 TAHAPAN DNA REKOMBINAN
1.4. Washing/Purifikasi
֎ Menghilangkan debris seluler (protein, lipid, polisakarida, komponen organik dan anorganik) dan
material yang tidak diinginkan
֎ DNA dicuci dengan isopropanol atau absolute etanol
֎ Untuk mendapatkan DNA dengan Kemurnian tinggi

1.5. Elution
֎ Menggunakan elution buffer
dan dengan proses sentrifuge
sehingga DNA dapat
dipindahkan pada tabung yang
steril
֎ DNA hasil isolasi kemudian
disimpan pada suhu -20 untuk
dianalisis lebih lanjut (proses
PCR)
2. Amplifikasi (Perbanyakan Fragmen DNA)
2.1. PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Teknik amplikasi DNA secara invitro pada
daerah spesifik yang dibatasi oleh sepasang
primer
• Setiap urutan basa nukleotida yang diamplikasi
akan menjadi 2 kali jumlahnya, pada setiap n
siklus PCR akan memperloleh 2n kali banyaknya
DNA target
TAHAPAN
Denaturasi
(penempelan primer)
Komponen yang dibutuhkan : DNA template hasil isolasi
(konsentrasi 0.1ug/ul-1 ng/ul), sepasang primer (forward dan
reverse) (konsentrasi 10 pmol/ul), PCR mix yang terdiri atas
dNTPs( Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR,
Magnisium Klroida (MgCl2), enzim polimerase DNA dan
aquades steril (Nughroho dan Rahayu, 2018).
Anneling Extension
(Pemanjangan)
(Stanfield, et.al, 2006).
 3. Pemotongan DNA dengan Enzim Retriksi

• Molekul plasmid yang digunakan sebagai vektor harus dipotong untuk membuka DNA lingkaram sehingga
molekul DNA asing bisa disisipkan

• Enzim retriksi merupakan suatu endonuklase yang mengenal urutan spesifik pada molekul DNA dan
memotong pada urutan yang spesifik
4. Penyambungan DNA dengan Enzim Ligase
• Enzim ligase digunakan untuk menyambungkan ujung-ujung nukleotida.

• Enzim ligase akan membentuk ikatan fosfodiester antara satu basa nitrogen dengan basa nitrogen lain

• Setelah proses penyambungan ini maka plasmid vektor mengandung DNA asli dan DNA sisipan
 5. Transformasi DNA
• Proses memasukkan DNA rekombinan ke
dalam sel bakteri
• Sel harus diberi perlakuan agar menjadi sel
kompeten (mampu menerima DNA dari luar)

Di dalam laboratorium, proses transformasi dilakukan

secara kimiawi dan secara fisika

Proses transformasi secara kimiawi bisa dilakukan dengan CaCl2

(kalsium klorida)

Proses transformasi secara fisika dengan menggunakan elektroporasi

menggunakan arus listrik
 5. Transformasi DNA
Transformasi DNA Rekombinan dengan
CaCl2
• Sel bakteri diletakkan pada larutan CaCl2 dingin
• Kemudian suhu tinggi diberikan untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel kompeten heat-shock
• Sel DNA plasmid rekombinan didinginkan dalam waktu yang lama dipanaskan dengan segera pada shu 42

(Brown, 2010)
 5. Transformasi DNA
Transformasi DNA Rekombinan dengan
Elektroporasi
•Menggunakan suatu alat yang dialiri arus listrik yang terkontrol voltase

•Kemudian suhu tinggi diberikan untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel kompeten heat-shock
(Casali dan Preston, 2003)
 6. Seleksi Klon Rekombinan
• Sel inang yang ditransformasi ditumbuhkan pada media padat pada suhu 37
• Hasil dari transformasi akan berbentuk koloni sel (klon/transforman)
• Klon terdiri dari gen target dan bukan gen target oleh karena itu perlu dilakukan
seleksi

1) Seleksi berdasarkan sifat yang resistan terhadap antibiotik

Misalnya gen Amp (gen resistan ampisilin) dan gen Tet (gen resistan terhadap tetraciclin)
• Penyisipan DNA asing dilakukan dalam gen Tet, sehingga bila mengandung sisipan DNA asing
gen Tet tidak akan aktif
• Bakteri transforman pertama ditumbukan pada media yang mengandung ampicilin, sehingga
koloni tumbuh adalah koloni yang membawa plasmid
• Koloni-koloni dipindahkan ke media yang mengandung tetracilin, sehingga koloni yang
mengandung DNA sisipan (dimana gen Tetranya sudah tidak aktif) tidak akan tumbuh
 6. Seleksi Klon Rekombinan
2) Seleksi dengan melibatkan gen LacZ
Seleksi ini plasmid yang digunakan menggunakan gen Amp dan gen LacZ.
Gen LacZ mengkode enzim – galaktosidase yang mengkatalis pemecahan
laktosa menjadi glukosa dan galaktosa
• Penyisipan DNA dilakukan didlam gen LacZ, sehingga mengandung DNA
sisipan maka gen LacZ akan inaktif
• IPTG(isopropil tiagalaktopiranosida) digunakan sebagai inducer
• Bakteri transforman ditumbuhkan pada media yang mengandung
ampicilin, X-gal dan IPTG
• Koloni yang tumbuh adalah koloni yang membawa plasmid; koloni yang
tumbuh berwarna hitam dan biru

• Koloni yang berwarna biru menandakan terdapat senyawa

5-bromo-4 kloro-3-indigo(hasil penguraian X-gal dan 𝛽 –
galaktosidase) artinya gen LacZ aktif tidak ada DNA sisipan
• Koloni yang berwarna putih tidak menghasilkan senyawa
berwarna dimana gen LacZ inaktif dan mengandung DNA
sisipan diantara gen LacZ
03
Manfaat dan
Dampak
Rekombinan
 Dampak Positif DNA Rekombinan

Peningkatan Peningkatan cara

produksi pangan pengolahan Limbah

Peningkatan Upaya Penyediaan bahan

Kesehatan Manusia alternatif
 Produk DNA Rekombinan

Insulin untuk
Faktor VIII untuk laki- Hormone pertumbuhan
penderita diabetes
laki penderita hemophilia manusia
a Erythropoiten untuk
mengobati anemia

Faktor IX untuk Interferon

hemophilia b Antibodi monoclonal Interleukin
 Kontroversi DNA Rekombinan

Aspek Agama Aspek Lingkungan

Penggunaan tanaman transgenik yang resisten terhadap
Xenotransplantasi serta kloning stem cell dari
herbisida akan mengakibatkan peningkatan kadar gula
embrio manusia untuk kepentingan medis
dalam akar akan makin banyak cendawan dan bakteri
dianggap sebagak bentuk pelanggaran
yang menyerangterjadi peningkatan jlh dan jenis
terhadap norma agama
mikroorganisme yang menyerang tanaman transgenik
tahan herbisidamemerlukan penggunaan pestisda
yang lebih banyak

Aspek Kesehatan
Transfer genetik didalam tubuh organisme akan muncul bahan
kimia baru yang berpotensi menimbulkan pengaruh roksisitas
Aspek Ekonomi
pada bahan pangan Hasil rekayasa genetika telah memberikan
• transfer gen tertentu dari ikan kedalam tomat yang tidak ancama persaingan serius terhadap
pernah berlangsung secara alami berpotensi menimbulkan komoditas serupa yang dihasilkan secara
resiko toksisitas yang membahayakan kesehatan konvensional
• Pernah ditemukan kontaminan toksik dari bakteri transgenik
yang digunakan untuk pelengkapan makanan tripofan
 Daftar Pustaka
Brown. T.A. (2010). Gene cloning and DNA analysis : An Introduction. 6 th ed. England:
Wiley-Blackwell Publishing. Oxford.

Casali, N. dan Preston, A. (2003). E. coli plasmid vectors : methods and applications. New
Jersey: Humana Press

Nugroho, E.D.,dan Rahayu. (2018). Pengantar bioteknologi (teori dan aplikasi).Yogyakarta:

Depublish

Stanfield, W.D., Colome, J.S., Cono, R. J. (2006). Schaum’s Easy Otlines, Biologi
Molekuler dan Sel. Jakarta: Erlangga

Thieman, W.J. & Palladino, M.A. (2013). Introduction of Biotechnology, 3rd Edition. United
State of America: Pearson. Education Inc.