MATA KULIAH BIOTEKNOLOGI

Sekuensing DNA

Dosen Pengampu : Apt. Robby Najini

Kelompok / Kelas : K 16 / FARMASI REG A
Nama Anggota:
1. Sisilia (I1021191028)
2. Syila Malinda Oktaviani (I1021191030)
3. Retno Sulistyaningrum (I1021191036)
4. Michelle Priscilla (I1021191043)
5. Fina Ari Ibah (I1021191045)
 Sekuensing DNA
Teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA.
• Hasil urutan : sekuens DNA
• Tujuan : menentukan urutan basa nitrogen (adenin, guanin, sitosin, dan
timin) suatu sampel DNA.
• Aplikasi : kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.
 Sejarah
1965 1971 1975

Robert Holley & team Frederick Sanger & Alan

Ray Wu & Ellen Taylor
Sekuens molekul asam Coulson
Sekuens DNA sepanjang 12
nukleat pertama Teknik sekuensing DNA plus-
nukleotida dari virus
minus

1977 Mid 1980 1986

Allan Maxam & Walter Metode Sanger lebih umum Leroy Hood
Gilbert digunakan Mesin sekuensing DNA
Metode sekuens DNA otomatis dengan metode
Maxam Sanger
 Prinsip
Metode Sanger
Menggunakan larutan dNTPs (Deoxynucleotides Triphosphates) untuk mensintesis
molekul DNA baru dan ddNTPs (Dideoxynucleotides Triphosphates) yang akan
menghentikan pemanjangan molekul DNA pada basa tertentu.

Mesin Sekuensing
• Preparasi sampel dari hasil klon / hasil PCR
• Cycle sequencing : proses pelabelan DNA dengan ddNTP
• Purifikasi : membersihkan DNA template dari sisa pereaksi PCR
• Denaturasi : memisahkan double strain menjadi single strain
• Run : elektroforesis didalam sekuenser
DNA (Deoxyribo Nucleic Acid)
● Asam nukleat yang menyimpan segala informasi biologis dari
setiap makluk hidup.
● DNA mengandung 4 basa, Adenine (A), cytosine (C), guanine
(G), dan timin (T)
● Barisan pada DNA dikenal dengan sekuen DNA yang merupakan
suatu untaian nukleotida.
● Barisan tersebut selanjutnya akan dilakukan pengurutan DNA.
● Pengurutan DNA (Sekuensing) digunakan untuk mengidentifikasi
kemiripan antar barisan DNA sehingga dapat dilakukan
klasifikasi pada DNA yang sejenis.

(Ernawati, 2014)
 Komponen Sekuensing DNA

DNA Template DNA Primer DNA Polimerase I

Cetakan untuk transkripsi Untuk menambahkan nukleotida Untuk mengisi celah DNA yang
DNA pertama pada sintesis DNA. muncul selama replikasi dan sintesis
DNA

(Chen CY et al, 2014)

dNTP ddNTPs
Bahan penyususn DNA Menghentikan/Memutus
reaksi pemanjangan untaian
DNA/sintesis DNA
METODE
 Metode Maxam Gilbert (Degradasi Kimia)
Prinsip

Pemotongan ujung molekul DNA

berlabel dengan agen kimiawi yang
spesifik

Kelebihan Kelemahan

Dapat langsung menggunakan DNA • Kerumitan teknis

hasil pemurnian • Menggunakan bahan kimia yang
berbahaya
• Kesulitan dalam scale up
Tahapan Metode Maxam Gilbert
1. Mula-mula molekul DNA rantai ganda yang akan disekuensing dilabel salah satu ujungnya
menggunakan fosfat radioaktif
2. Fragmen DNA yang sudah dilabel pada salah satu ujungnya dipotong tak sempurna (partial
digest) dalam empat reaksi kimia terpisah menggunakan pereaksi asam format, dimetil
sulfat, hydrazine, dan natrium klorida.
3. Tiap reaksi membuat fragmen DNA tersebut terpotong pada basa tertentu menghasilkan
empat macam populasi fragmen DNA yaitu A, G+A, C dan C+T
4. Populasi fragmen dipisahkan dengan cara elektroforesis melalui gel polyacrilamida dan
fragmen DNA yang berlabel pada ujungnya tersebut akan terdeteksi melalui cara
autoradiografi.
Video yang menggambarkan tahapan metode Maxam Gilbert lebih jelas :
https://www.youtube.com/watch?v=_B5Dj8PL4E0
 Metode Sanger (Terminasi Rantai)
Prinsip
Menggunakan DNA templat dan memerlukan
primer spesifik untuk reaksi sekuensingnya.
Panjang sekuen yang dihasilkan berkisar antara
1.000-1.200 pasang basa (bp) dan tidak mampu
mencapai lebih dari 2.000 bp

Kelebihan
• Lebih mudah,
• Praktis,
• Efisien, dan
• Banyak yang telah berhasil disekuensing
 Tahapan Metode Sanger

Reaksi PCR dengan

memperbanyak fragmen
DNA

Pemotongan Kloning Sintesis

Dipotong dengan enzim Sintesis molekul DNA baru
restriksi dan pemberhentian sintesis
dengan basa tertentu.
dNTP  bahan utama
ddNTP  menghentikan
proses sintesis
 Pengaplikasian
Human Genome Project
Manfaat dari diketahuinya sekuen lengkap genom manusia, maka dapat didiagnosis dan
selanjutnya dikembangkan pengobatan untuk penyakit genetik.

Next Generation Sequencing (NGS)

NGS atau biasa yang disebut dengan sekuensing parallel. Salah satu aplikasi dari NGS adalah
CRC atau Kanker Kolorektal. Penggunaannya mengarah pada produksi hasil yang
signifikan tentang identifikasi mutasi baru / gen yang diubah atau penataan ulang genom
dan kemungkinan evaluasi respons terapi.
 Pengaplikasian
Human Genome Project
Manfaat dari diketahuinya sekuen lengkap genom manusia, maka dapat didiagnosis dan
selanjutnya dikembangkan pengobatan untuk penyakit genetik.

Next Generation Sequencing (NGS)

NGS atau biasa yang disebut dengan sekuensing parallel. Salah satu aplikasi dari NGS adalah
CRC atau Kanker Kolorektal. Penggunaannya mengarah pada produksi hasil yang
signifikan tentang identifikasi mutasi baru / gen yang diubah atau penataan ulang genom
dan kemungkinan evaluasi respons terapi.
 Pengaplikasian
Third Generation Sequencing Platforms
Dapat menyekuen individdu molekul DNA dan RNA, mampu membaca urutan molekul
DNA yang berasal dari molekul tunggal.
Daftar Pustaka
Chen CY et al. 2014. DNA polymerases drive DNA sequencing-by-synthesis
technologies : both past and present. Frontiers in MICROBIOLOGY ; 5 : 1-11

Ernawati. 2014. Implementasi Algoritma Smith-Watermap Pada Local Aligment dalam

Pencairan Kesamaan Pensejaajaran Barisan DNA. Jurnal Pseudocode ; 1(2) : 1-8

Muthiadin C. 2014. Pengantar Rekayasa Genetika. Universitas Islam Negeri Alauddin :

Makassar.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda:

Bogor.
 Daftar Pustaka
Ridwan, Roni. 2008. Mengenal Alat Analisa Molekuler; DNA Sequencing, DNA Microarray,
dan Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Bio Trends. 3(1): 22-26.
Rogers, K. ed. 2011. New Thinking about Genetics, New York: Britannica Educational
Publishing, hal 132
Sambrook, J., Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Volume ke-2 (ed.
3). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. hal. 12.3
Tasma, I Made. 2015. PEMANFAATAN TEKNOLOGI SEKUENSING GENOM UNTUK
MEMPERCEPAT PROGRAM PEMULIAAN TANAMAN. J. Litbang Pert. 34(4) : 159-
168.
 Daftar Pustaka
Vecchio FD et al. 2017. Next-generation sequencing: recent applications to the analysis of
colorectal cancer. Journal of Translational Medicine. 15 (246):1-19.