Pertemuan 12

TEKNIK DASAR BIOLOGI

MOLEKULER UNTUK ASAM
NUKLEAT

apt. Novycha Auliafendri, S.Farm., M.Si

• Teknik dasar analisis biologi molekuler
untuk DNA di antaranya dengan cara
hibridisasi.
• Pada metode ini dibuat pelacak (probe)
yang merupakan untaian asam nukleat
yang kira-kira sesuai/ serasi dengan DNA
yang akan dideteksi.
• Ketepatan metode ini rata-rata di bawah 80%.
Teknologi paling akurat untuk mendeteksi asam
nukleat adalah Polymerase Chain Reaction (PCR)
yang memiliki ketepatan hingga 100%.
• Pada metode PCR suatu segmen asam nukleat
diperbanyak (diamplifikasi) menggunakan panduan
primer yaitu batasan sekuen basa nitrogen yang
ada pada hulu dan hilir segmen yang dimaksud.
Teknik Dasar Analisis Biologi Molekuler Untuk
Asam Nukleat (DNA atau RNA)

Hibridisasi dengan Probe Asam nukleat dalam bentuk

larutan

Hibridisasi dengan menggunakan matriks padat

Hibridisasi in situ

Polimorfisme Komformasional untai tunggal

Mikroarray

Reaksi Rantai Polimerase

Hibridisasi dengan Probe Asam nukleat dalam bentuk larutan

• Probe asam nukleat dapat

diciptakan untuk mengidentifikasi
potongan DNA tertentu dengan
mensintesis protein “pemancing”
dengan rangkaian yang
merupakan komplementer
terhadap potongan DNA yang
dituju.

• Probe asam nukleat dengan rangkaian tertentu dapat

digunakan untuk mengikat dan dengan demikian
mengidentifikasi potongan komplementer DNA.
• Pendekatan yang disebut hibridisasi ini adalah sebuah proses
kunci dan merupakan dasar untuk beberapa teknik biologi
molekuler.
• semakin panjang probe, semakin besar kecenderungannya bahwa
probe tersebut akan bersifat spesifik.
• Langkah pertama dalam teknik hibridisasi adalah denaturasi
cetakan DNA dengan suhu tinggi untuk memutus ikatan
hidrogen di antara pasangan-pasangan basa komplementer.
• Panas menyebabkan pemisahan kedua untai DNA dengan
memutus semua ikatan hidrogen yang menghubungkan kedua
untai DNA; suhu yang diperlukan untuk pemutusan ini bergantung
pada rangkaian DNA tertentu (misalnya, ikatan sitosin-guanin
dengan 3 ikatan hidrogen lebih kuat dari pada ikatan adenosin-
timin yang hanya berikatan dengan 2 ikatan hidrogen;
• oleh sebab itu, ikatan sitosin-guanin memerlukan panas yang
lebih besar untuk dapat memutus ikatan tersebut, ukuran
potongan DNA yang akan didenaturasi, dan konsentrasi garam.
• Pendidihan larutan DNA dilanjutkan dengan mendinginkannya
secara cepat ke es (untuk mencegah penggabungan kembali
kedua untai) seringkali digunakan untuk “melepaskan
sambungan” untai-untai DNA dan membukanya sehingga probe
dapat berikatan dengan rangkaian komplementernya.
 Hibridisasi fluoresensi in situ (FISH) adalah tes
molekuler yang dilakukan ahli patologi untuk
mempelajari lebih lanjut tentang materi
genetik dalam sel. IKAN biasanya digunakan
untuk mencari perubahan genetik pada tumor.

Hibridisasi fluoresensi in situ menggunakan probe fluoresen yang telah

dirancang untuk menempel pada segmen unik DNA (target).
Probe FISH disebut fluorescent karena mereka hanya menghasilkan
warna ketika terkena jenis cahaya tertentu. Akibatnya, ahli patologi
perlu menggunakan jenis mikroskop khusus yang dapat menghasilkan
jenis cahaya tertentu dan mendeteksi warna yang berasal dari probe.

Hasilnya ditangkap dalam gambar di komputer untuk

analisis lebih lanjut. Ketika probe menemukan perubahan
lokasi DNA target, hasilnya disebut translokasi. Ketika
probe menemukan perubahan dalam jumlah total DNA
target, hasilnya disebut amplifikasi atau penghapusan
tergantung pada jenis perubahan yang diidentifikasi.​
 Prinsip kerja dari teknik FISH adalah dengan
mempersiapkan elemen dasar probe DNA dan urutan
target yang diinginkan (Gambar 1A) dalam hal ini probe
yang dipilih harus spesifik, sensitif dan mudah untuk
masuk dalam jaringan (Moter & Gobel, 2000), karena
pemilihan probe sangat penting dalam menganalisis
kelainan genetik (Bishop, 2010). Sebelum dilakukan tahap
hibridisasi, probe DNA diberi label secara tidak langsung
dengan hapten atau diberi label secara langsung dengan
menggunakan penggabungan fluorophore (gambar 1B)
(Bishop, 2010). Cara yang umum dipakai adalah cara
langsung karena tidak memerlukan langkah deteksi lanjut
setelah dihibridisasi sehingga lebih mudah, murah dan
cepat (Moter, & Gobel, 2000).

Selanjutnya probe DNA berlabel dan DNA target didenaturasi untuk menghasilkan
untaian DNA tunggal (gambar 1C). Kemudian probe DNA dan DNA target
digabungkan, memungkinkan annealing of complementary urutan DNA (gambar 1D)
pada probe yang dilabel secara tidak langsung maka diperlukan langkah tambahan
untuk memvisualisasi hapten non-fluoresensi dengan menggunakan sistem deteksi
enzimatik atau imunologi, selanjutnya sinyal dapat dievaluasi dengan menggunakan
mikroskop fluoresens (gambar 1E) (Bishop, 2010).
 Mikroaray

Mikroaray: teknologi yang

digunakan untuk melihat
urutan sekuens asam nukleat
yang berada pada lokasi
tertentu dan dapat digunakan
untuk menganalisis beribu-
ribu sampel pada waktu yang
bersamaan.
Prinsipnya adalah
mengandalkan kemampuan
DNA sampel yang telah
dilabel dengan zat
fluorescent untuk melakukan
rekombinasi dengan probe
yang telah ada pada chip
microarray (Stekel 2003).
 PRINSIP REAKSI PCR

• Denaturation / denaturasi
(96°C): Pada proses denaturasi, panas
mempengaruhi strand DNA akan terpisah
menjadi DNA beruntai tunggal (single-
stranded).
• Annealing / penempelan
(55-65°C): Pada tahap penempelan ini,
suhu annealing primer akan menempel
dan berikatan pada daerah komplementer
pada sekuen single- stranded DNA.
• Extension / elongasi (72°C):
Pada suhu ini Taq polymerase
melakukan pemanjangan membentuk
strand DNA baru.