BIOLOGI MOLEKULER

KELOMPOK IV
ARYATI TELLENG
CLAUDIA KONDOY
FRANGKLIN BARAPA
NADIA UMBAS
 Restriction Fragment Length Polymorphism

2 4
Kelebihan &
Aplikasi RFLP
1 3 Kekurangan

Pengertian RFLP Tahapan RFLP

PENGERTIAN RFLP
sebagai penduga variasi DNA.
RFLP merupakan Marka molekuler yang RFLP bersifat kodominan
Fungsi sehingga dapat mendeteksi
menggunakan enzim restriksi dalam adanya heterozigositas dan
mengidentifikasi sekuensi-sekuensi DNA tidak diperlukan informasi
sekuens target

Analisis RFLP adalah salah satu teknik pertama yang secara luas
digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuens DNA.

Deteksi RFLP didasarkan pada adanya kemungkinan untuk membandingkan profil pita-
pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan oleh enzim restriksi terhadap DNA
target
APLIKASI RFLP
biasanya digunakan untuk :

Mendeteksi diversitas genetik, hubungan kekerabatan, sejarah

domestifikasi, asal dan evolusi suatu spesies, aliran gen dan seleksi,

Pengamanan gen-gen target yang akan diekspresikan

mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar serta mengkonstruksi

pustaka DNA

Mengidentifikasi perbedaan pada tingkat populasi, spesies, atau individu

TAHAPAN RFLP
ISOLASI DNA

PEMOTONGAN DENGAN ENZIM RESTRIKSI

ELEKTROFORENSIS GEL

TRANSFER DNA

HIBRIDISASI
ISOLASI DNA
Metode untuk mendapatkan asam deoksiribonukleat dari suatu makhluk hidup.

Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang
harus diisolasi terlebih dahulu dan murni kandungannya.

Prinsip Kerja

dengan memecah, menghancurkan dan mengekstraksi

jaringan atau sel sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang
terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA.
TAHAP ISOLASI DNA
1
Proses perusakan atau penghancuran membran dan
Pelisisan dinding sel

seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar

Cara Fisik
dan pestle dalam nitrogen cair

menggunakan proteinase K untuk melisiskan membran

Cara kimiawi pada sel darah serta mendegradasi protein globular
maupun rantai polipeptida dalam komponen sel

seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan

Cara Enzimatik lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi
membran sel
TAHAP ISOLASI DNA
2
Memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
Sentrifugasi dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di
atas

3
Ekstraksi bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel

4
o bertujuan untuk membersihkan nukleus sel dari kontaminan
seperti senyawa sekunder (fenol) dan polisakarida, RNA dan
juga protein.
Purifikasi o Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA dilakukan
menggunakan senyawa kloroform isoamilalkohol dan asam
asetat berfungsi mendenaturasi protein , serta enzim RNAse
berfungsi melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut
TAHAP ISOLASI DNA
5
Berfungsi untuk memisahkan senyawa DNA dari campuran
Sentrifugasi material dan komponen intraceluler yang mengandung
larutan kompleks berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat

6
Bertujuan untuk mengendapkan protein, sehingga untai-
Presipitasi untai DNA tidak lagi menggulung (coiling), yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat

Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan menggunakan isopropanol

dingin yang bertujuan agar DNA tersebut mengendap/mengumpul
sekaligus memisahkannya dari garam-garam mineral sisa
PEMOTONGAN DENGAN
ENZIM RESTRIKSI
DNA murni hasil isolasi
DNA akan dipotong dengan enzim
restriksi endonuclease yang akan
membentuk potongan DNA spesifik

Enzim-enzim ini bekerja dengan

Enzim Restriksi Endonuklease
memotong DNA pada lokasi -
memotong DNA tepat pada ikatan
lokasi spesifik yang mampu
fosfodiester
mengenali urutan nukleotida.
Hasil Pemotongan
Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif
(sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Sticky end Blunt end

 bersifat lengket mudah untuk  bersifat tumpul dan sulit untuk
disambung. disambung
ENZIM RESTRIKSI
DENGAN
SEKUENS
PENGENALNYA
Faktor yang mempengaruhi Pengaruh Kation
kerja enzim restriksi

Suhu Komposisi Buffer

Kekuatan Ionik Waktu Reaksi

pH Lama Inkubasi
ELEKTROFORENSIS GEL
Suatu proses migrasi molekul bermuatan di
dalam suatu media yang bermuatan listrik,
dimana kecepatan migrasinya tergantung pada
muatan, ukuran dan bentuk setiap molekul yang
terlibat.

Prinsip dasar
Saat elektroforesis berlangsung, protein akan
bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda
positif sampai pada jarak tertentu pada gel
tergantung pada berat molekulnya
Hasil Elektroforensis Gel

Akan membentuk pola khusus untuk setiap

sampel.

Pola dapat dilihat dengan pewarnaan

etidium bromide
TRANSFER DNA
DNA yang telah diperoleh kemudian
ditransfer ke membran nitroseluloasa,
tahap inilah yang disebut dengan
blotting

Salah satu metode tahapan transfer

DNA ke membran nitroselulosa yang
berdasarkan pada Prinsip Kapilaritas

Kapilaritas adalah peristiwa naiknya

zat cair pada pembuluh, celah atau
pori-pori kecil Proses transfer DNA dengan
prinsip kapilaritas
Proses transfer kapiler DNA dari gel agarosa ke membran
HIBRIDISASI
Proses identifikasi gen-gen hasil analisis RFLP dengan restriksi enzim yang sesuai
dan diidentifikasi dengan fragmen gen target yang spefisifik yang telah diberi label
baik dengan radioaktif maupun non radioaktif.

Teknik hibridisasi meliputi dua proses

Proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam

1
nikleat yang komplementer,

2 Proses denaturasi atau perpaduan kembali dua rantai

asam nukleat
 DNA terikat di
membran

Hibridisasi
dengan probe
spesifik
PROSES Probe berikatan
HIBRIDISASI dengan fragmen
DNA target

Proses sisanya Visualisasi

dicuci dari pada film
membran hasil sinar-X
Langkah kerja Hibridisasi
Membran membran didenaturasi di bufer denaturasi, sehingga kita mempunyai
dengan pita tunggal DNA dan proses prehibridisasi.

Lakukan inkubasi pada suhu 60°C semalaman

Untuk penggunaan probe radioaktif, gunakan wadah khusus untuk proses hibridisasi
ini, letakkan membran di wadah dan masukkan larutan probe sesedikit mungkin.

kemudian masukkan ke kantong plastik yang sesuai ukuran membran dan berisi
cairan probe spesifik yang juga merupakan pita tunggal DNA

Plastik ditutup rapat, hindari adanya gelembung di dalamnya karena akan

menghambat kerja probe. Bila ada gelembung, keluarkan hati-hati secara vakum

Inkubasi pada suhu 60°C sampai waktu yang telah ditetapkan.

Langkah kerja Hibridisasi
DNA probe akan menghibridisasi urutan basa nukleotida yang komplemen saja,
sedangkan urutan basa lainnya tidak

Kemudian, cuci membran sampai bersih dari sisa larutan probe. Bila
menggunakan probe radioaktif, perhatikan pembuangan sisa larutan probe
maupun larutan pencuci yang harus dibuang di tempat khusus yang terlabel
rdioaktif, karena pembuangan akhir akan ditangani oleh lembaga khusus yang
bertanggung jawab terhadap keamanan zat-zat radioaktif.

Visualisasi hasil hibridisasi dilakukan di ruang gelap.

Membran diekspos dengan sinar-X pada film khusus, kemudian, film dicuci seperti
mencuci film pada umumnya. Setelah film dicuci, kemudian dikeringanginkan. Hasil
bisa diidentifikasi di atas boks lampu
 DETEKSI DNA
Merupakan tahap lanjutan dari proses
hibridisasi DNA yang menggunakan
pelacak/probe.

Pada tahap deteksi DNA digunakan

Autoradiogram untuk melihat lokasi sinyal
DNA.

Probe biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas
spesifik radionukletida.
 KELEBIHAN KEKURANGAN
 Menduga hubungan kekerabatan dari  Dibutuhkannya DNA dengan kemurnian
beberapa individu yang dianalisis, yang tinggi dalam jumlah banyak
 Menduga ada tidaknya variasi genetik dari  Tidak mungkin dilakukan otomatisasi
koleksi plama nutfah
 Pada beberapa spesies mempunyai level
 Memonitor proses seleksi (melalui linkage) polimorfisme yang rendah
berbagai karakter
 Sedikit lokus yang terdeteksi
 Memilah-milah komponen genetik dari
 Memerlukan pustaka probe yang sesuai
karakter kuantitatif
 Membutuhkan waktu yang banyak
 Menganalisis gen yang berasal dari proses
transformasi genetik  Membutuhkan biaya yang besar
 Memiliki kemampuan memisahkan yang
tinggi pada tingkat spesies, populasi.
TERIMA KASIH