ANALISIS PRODUK

REKOMBINAN

Prodi Farmasi Matakuliah Bioteknologi Lisa Savitri, S.Si., M.Imun.

 Analisis
berbasis DNA
Analisis Produk
Rekombinan Analisis
berbasis
protein

Prodi Farmasi Matakuliah Bioteknologi Lisa Savitri, S.Si., M.Imun.

 1. Analisis Berbasis DNA

Prodi Farmasi Matakuliah Bioteknologi Lisa Savitri, S.Si., M.Imun.

• Komponen utama kromosom pada eukariot adalah
DNA dan protein
• Protein histon bersifat basa, sehingga dapat
menetralkan sifat asam dari DNA
• DNA berdasarkan letaknya ada 2 macam, yaitu DNA
kromosomal dan DNA ekstrakromosomal
• Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah
untuk memecahkan dinding sel dan membran inti,
yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari
berbagai komponen sel yang lain
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA

1. Proses Pengeluaran
DNA Senyawa yang biasa
digunakan untuk
memaksimalkan hasil
isolat DNA yang murni
ditambahkan fenol,
Dengan cara diekstraksi
atau dilisiskan kloroform, dan
isoamil alkohol

Sampel dimasukkan ke
Penambahan buffer
dalam nitrogen cair dan
ekstraksi atau buffer lisis
langsung digerus sebelum
untuk mencegah
ditambahkan buffer
kerusakan DNA
ekstraksi
2. Pemisahan DNA. Pemisahan
DNA dari komponen sel yang
lain atau kontaminan yang
tidak diinginakn, termasuk
debris sel, dilakukan dengan
sentrifugasi

3. Presipitasi DNA.
Menggunakan etanol absolut
atau isopropanol. Selain DNA,
semua bahan yang lain akan
larut dalam etanol dingin
• Selama proses ekstraksi DNA, beberapa hal yang dapat
terjadi antara lain:

• DNA patah-patah selama proses isolasi

• DNA terdegradasi oleh enzim nuklease

• Terjadi kontaminasi oleh polisakarida

• Metabolit sekunder ikut terisolasi

Denaturasi dan Renaturasi DNA

Proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA tergantung

pada banyak faktor, antara lain:

Derajat Perbandingan
keasaman (pH) kandungan
Konsentrasi
Suhu yang ekstrem antara basa
isoelektrolit
(pH<3 atau nukleotida GC
pH>10) terhadap AT
Uji Kuantitatif DNA
• Uji kuantitatif DNA/RNA dengan spektrofotometer
UV-Vis
• DNA murni dapat menyerap
cahaya UV karena adanya
basa purin dan purimidin
• Pita ganda DNA/RNA dapat
menyerap cahaya pada
260 nm
• Kontaminan protein atau
fenol akan menyerap cahaya
280 nm
• Kemurnian DNA/RNA dapat diukur dengan
menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagai dengan
nilai absorbansi 280
• Nilai kemurnian DNA dan RNA berkisar 1,8-2,0
• Untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus
sebagai berikut:

Rumus hasil uji kuantitatif DNA

[DNA]= Å260 x 50 x faktor pengenceran
Rumus hasil uji kuantitatif RNA
[RNA]= Å260 x 40 x faktor pengenceran
Uji Kualitatif DNA

• Metode standar yang digunakan untuk identifikasi,

pemisahan, dan purifikasi fragmen DNA adalah
dengan menggunkan elektroforesis gel agarosa
• Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa
dipengaruhi oleh

• Faktor ukuran dan konformasi molekul DNA

• Konsentrasi agarosa

• Arus listrik

• Suhu
• Pewarna etidium bromida (EtBr) digunakan untuk
alat identifikasi dan mengukur semikualitatif fragmen
DNA yang terpisah dalam gel
• EtBr akan terikat di antara dua untai ganda DNA,
sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar
• Ikatan DNA-EtBr ini akan terekspos pada sinar UV
level medium, sekitar panjang gelombang 300 nm
Hibridisasi

• Mekanisme dasar di balik uji-uji diagnostik yang

menggunakan probe asam nukleat adalah hibridisasi
• Uji-uji yang menggunakan hibridisasi membutuhkan
proses denaturasi dan fragmen asam nukleat yang
tidak diketahui dan memfiksasi fragmen tersebut
pada bahan solid seperti membran
nilon/nitroselulosa
• Prinsip pemindahan DNA dari gel menuju membran
berlangsung secara kapileri, dengan demikian sistem
yang digunakan adalah capillary transfer
• Proses hibridisasi juga dapat dilakukan dalam larutan
(bukan bahan solid)
• DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe
dimasukkan ke dalam larutan buffer
• Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses
hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat
daripada dilakukan pada bahan solid
• Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan
transfer DNA dari gel agarosa ke nilon berpori atau
membran nitroselulosa
 Proses denaturasi
atau pemisahan dua
rantai asam nukleat
yang komplementer
Teknik hibridisasi
meliputi 2 proses
Proses renaturasi
atau perpaduan
kembali dua rantai
Langkah-langkah Kerja asam nukleat
Hibridisasi DNA

Isolasi DNA

Pemotongan
dengan enzim
restriksi (digesti
restriksi)

Transfer DNA
 2. Analisis Berbasis Protein

Prodi Farmasi Matakuliah Bioteknologi Lisa Savitri, S.Si., M.Imun.

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan suatu

metode pemisahan molekul
yang menggunakan medan
listrik (elektro) sebagai
penggerak molekul dan matriks
penyangga berpori (foresis)
Elektroforesis digunakan untuk
memisahkan molekul yang
bermuatan atau dibuat
bermuatan

Elektroforesis dapat
memisahkan protein
berdasarkan berat molekulnya
(menggunakan SDS-PAGE) atau
berdasarkan titik isoelektriknya
(menggunakan IEF)
• Elektroforesis merupakan proses bergeraknya
molekul bermuatan pada suatu medan listrik
• Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
terantung pada muatan, bentuk, dan ukuran
• Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan
matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi
karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan
• Gel polikrilamida dan agarosa merupakan matriks
penyangga yang banyak dipakai untuk pemisahan
protein dan asam nukleat
 Berdasarkan preparasi sampel,
elekroforesis dibagi dua, yaitu

Native atau nondenaturing atau non- Denaturing atau disosiasi atau SDS-
dissociation PAGE PAGE

Terputusnya ikatan disulfida

yang menentukan protein
folding, dengan kata lain
struktur sekunder protein rusak
Pengikatan protein dengan
SDS akan menyebabkan dua
hal, yaitu Menyebabkan bagian luar
molekul protein terselubungi
oleh muatan negatif dari SDS
sehingga molekul protein akan
berpisah berdasarkan berat
molekulnya
SDS-PAGE

• Analisis SDS-PAGE merupakan prosedur dasar dalam

banyak aplikasi analisis protein
• Pada Western blotting, SDS-PAGE merupakan tahap
awal untuk separasi protein sebelum protein
ditransfer pada membran poliviniliden difluorida
(PVDF)
• Pada prosedur purifikasi protein, SDS-PAGE dipakai
sebagai salah satu prosedur untuk menilai tingkat
kemurnian protein
SDS-PAGE merupakan suatu teknik dengan kegunaan
yang cukup luas, antara lain:
• Analisis kemurnian protein
• Penentuan berat molekul protein
• Verifikasi konsentrai protein
• Deteksi proteolisis
• Identifikasi protein imunopresipitasi
• Sebagai tahap awal imunoblotting
• Deteksi modifikasi protein
• Pemisahan dan pemekatan protein antigen
• Pemisahan protein terlabel radioaktif
Western Blotting
Western blotting atau immunoblotting adalah istilah
yang dipakai untuk proses transfer dan imunodeteksi
protein pada gel yang bertujuan untuk:
Menegetahui
keberadaan dan berat Membandingkan reaksi
molekul protein sampel silang antar protein
dalam suatu campuran

Mempelajari modifikasi
protein selama sintesis
• Imunodeteksi tidak dilakukan langsung pada gel
karena sifat gel yang rapuh untuk dapat melalui
proses inkubasi yang lama dan pencucian yang
berulang kali
• Untuk mengatasi hal ini, maka protein terlebih
dahulu ditransfer dari gel ke membran nitroselulosa
(NC) atau membran poliviniliden difluorida (PVDF)
 Membran digunakan sebagai tempat melekatnya protein yang
diuji, karena

Hasil protein Blot sesuai

Mengurangi Blot dapat
Mudah yang ditransfer untuk
lama inkubasi disimpan
manipulasiny (hasil blot) dapat berbagai
dan sampai 1
a dipakai lagi prosedur
pencucian bulan
untuk deteksi
mendeteksi
protein yang lain
(sesudah
diinkubasi
dengan detergen
untuk
menghilangkan
probing reagent)
Prosedur Western blotting terdiri dari 6 tahapan, yaitu:

Transfer protein
Preparasi sampel Pemisahan dari gel
(bertindak protein pada gel elektroforesis ke
sebagai antigen) elektroforesis membran PVDF
atau NC

Deteksi atau Memblokade

Penambahan
visualisasi lokasi ikatan
antibodi primer
pengikatan nonspesifik pada
dan sekunder
antigen-antibodi membran
 ~sekian
Prodi Farmasi Matakuliah Bioteknologi Lisa Savitri, S.Si., M.Imun.