Teknik Ekstraksi DNA,

PCR, dan Real Time PCR

Pendahuluan

 DNA merupakan biomolekul yang menyimpan dan

menyandi kode genetika makhluk hidup dan banyak
jenis virus.
 DNA polimer untai ganda yg tersusun dari
deoksiribonukleotida (basa purin (A,G) atau
pirimidin(C,T), gula pentosa,dan fosfat).
Komponen DNA
 DNA berada dalam sel sehingga untuk mendapatkannya
harus merusak dinding dan membran sel.
 Ekstraksi DNA

 Ekstraksi DNA : memisahkan DNA dari komponen

seluler lainnya.
 Ekstraksi DNA merupakan langkah yang tepat
untuk mempelajari DNA.
 Tujuan Ekstraksi DNA

 Tujuan ekstraksi DNA adalah agar DNA MH tersebut bisa

dianalisis.
 Analisis DNA meliputi :
o Identifikasi spesies
o Analisis Variasi intra spesies, termasuk di dalamnya sidik jari DNA
o Analisis gen
o Rekayasa Genetika
 Prinsip Ekstraksi DNA

 Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.

 Sentrifugasi : teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul
besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung.
 Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang
terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian
bawah.
 Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan
suatu komponen dari campuran.
 Tahapan Ekstraksi DNA

1. Perusakan dinding dan membran sel (Lisis sel).

2. Purifikasi DNA dari komponen lain.
3. Pencucian dan Resuspensi.

1)Isolasi sel; (2)Lisis dinding dan membran sel; (3)Ekstraksi dalam

larutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi
 1. Lisis Sel

 Pada ekstraksi DNA dari tanaman, tahapan ini terjadi

perusakan dinding sel dan membran seluler (membran plasma
dan nukleus).

1. Dinding sel (terbuat dari selulosa) dirusak dengan kekuatan mekanik (penambahan
reagen tertentu.
2. Penambahan detergen akan menghancurkan membran sel.
 Detergen mampu merusak membran karena amphipatic (memiliki bagin hidrofilik
dan hidrofobik), sehingga molekul detergen dapat memisahkan membran.
3. Akhir dari lisis yaitu bagian sel tersebar di dalam larutan.
 2. Purifikasi DNA dari Komponen
Lain

 Memisahkan DNA dari komponen seluler lainnya seperti

protein, lipid, RNA, dll.
 Secara efektif menginaktivasi endogenous nucleases (enzim
DNase) dan mencegahnya dari memotong DNA genom adalah
langkah kunci dalam proses purifikasi. DNAse dapat
diinaktivasi dengan panas atau chelating agents.
2. Purifikasi DNA dari Komponen Lain

1. Menggunakan fenol/kloroform untuk menghilangkan protein dari DNA.

 Fenol mendenaturasi protein dan melarutkan protein yang terdenaturasi.
 Kloroform juga merupakan protein denaturan.
2. Penambahan garam.
 Garam mengganggu ikatan hidrogen antara air dan molekul DNA.
3. DNA lalu dipresipitasi/diendapkan dari protein dengan isopropanol/etanol
 Dengan adanya kation, etanol menginduksi perubahan struktur molekul
DNA yang menyebabkan molekul DNA terpresipitasi dari larutan.
4. Dihasilkan pelet DNA dari sentrifugasi dan supernatan dibuang .
3. Pencucian dan Resuspensi

Pencucian:
DNA yang terpresipitasi mengandung garam asetat. DNA tersebut
“dicuci” dengan larutan etanol 70% untuk menghilangkan garam dan
pengotor lain yang larut air, tanpa meresuspensi DNA.

Resuspensi:
DNA yang bersih diresuspensi dalam buffer untuk meyakinkan stabilitas
dan penyimpanan jangka panjang. Buffer yang umum digunakan untuk
resuspensi yaitu 1xTE.
 Beberapa Penyebab Kegagalan
Ekstraksi DNA

 Rantai dingin yang kurang terjaga. Sediakan es.

 Tip pipet yang kurang steril. Gunakan tip steril.
 Ada bahan yang terlewatkan, tidak ikut diambahkan.
Tuliskan tahapan kerja, beri ceklis setiap selesai dikerjakan.
 Bekerja di ruangan ber-AC, gunakan masker dan sarung
tangan serta alkohol 70%.