ISOLASI DNA

Ditujukan untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah

Bioteknologi Farmasi

Oleh:
Kelompok 1
Ai Teni Siti Robiah
Anggiana Fitria Dewi
Citra Rahayu Febianti
Nisa Amelia
 Pendahuluan
DNA merupakan materi genetic yang diturunkan. Molekul DNA tersimpan di
dalam nucleus sel dan Sebagian kecil bisa di temukan di mitokondria .
Secara umum, struktur DNA yang konvensional adalah heliks ganda (double
helix); tersusun atas basa nitrogen Adenin, Guanin, Timin dan Sitosin; dan
merupakan polimer dari monomer nukleotida (fosfat-gula deoksiribosa-basa
nitrogen).
Pembawa informasi genetik

Berperan dalam duplikasi diri dan

pewarisan sifat
Fungsi
Ekspresi informasi genetik

Forensik
 Isolasi merupakan suatu teknik yang digunakan untuk
memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein
DNA??? dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. 

Tahapan isolasi DNA terdiri dari tiga tahapan,

yaitu:
- Lisis dinding dan membran sel
- Pemisahan atau purifikasi DNA
- Presipitasi DNA
 Sejarah Isolasi DNA

Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh ilmuwan

asal Swiss bernama Friedrich Miescher pada tahun
1869. Ia menemukan senyawa asam yang
mengandung nitrogen dan fosfat pada inti sel dari sel
darah putih. Senyawa ini diberi nama nuklein, namun
pada tahun 1889 muridnya yaitu Richard Altmann
menamainya asam nukleat.
 Prinsip Isolasi DNA

Sentrifugasi
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.

Presipitasi
Metode presipitasi adalah metode pengendapan masing-masing
material dasar dengan suatu reaktan. Hasil pengendapan tersebut
kemudian digabungkan untuk pembentukan senyawa yang
 Tahapan Isolasi
DNA
Ekstraksi
Sentrifugasi
Pelisisan Untuk memisahkan
Untuk memisahkan hasil
Untuk memecah dinding senyawa DNA dari
lisis daru DNA dengan
dan membrane sel protein, lipid dengan cara
kecepatan tertentu
pengocokan

Sentrifugasi Puriikasi
Presipitasi Untuk memisahkan Untuk memurnikan DNA
Untuk mendapatkan senyawa DNA dari dari kontaminan seperti
DNA pengotornya dengan senyawa sekunder
kecepatan tertentu (fenol), polisakarida
 Tahap Pelisisan
Secara Mekanik

• Penghancuran sel atau tahap penglisisan secara mekanik atau secara fisik
dilakukan dengan menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan
pastle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-
thawing, iradiasi, dapat pula dilakukan dengan sonikasi, pemberian tekanan
tingg.

Secara Kimiawi atau Enzimatis

• penghancuran dengan kimiawi atau enzimatis dilakukan dengan

penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membrane sel
sehingga terjadi destabilisasi membrane sel. Sementara cara enzimatik
seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membrane pada
sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida
dalam komponen sel
 Bahan yang Digunakan

berperan dalam melisiskan memberan sel juga dapat berperan

Deterjen dalam mengurangi aktivasi enzim nuclease yang merupakan
enzim pendegradasi DNA.

Sodium dodecyl sulphate (SDS) berperan dalam melisiskan

SDS
memberan sel.

Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai

CTAB untuk melisiskan membrane sel pada isolasi DNA tumbuhan
karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida.
Tahap Sentrifugasi
• CIAA (Kloroform, isoamil alcohol) berfungsi untuk mengendapkan protein, komponen
fenolik, dan polisakarida sehingga dapat dipisahkan dengan larutan DNA menggunakan
proses sentrifugasi. Setelah itu tube di centrifuge selama 15 menit ada 12.000 rpm untuk
mengendapkan molekul kasar yang bercampur dengan DNA (dinding sel, protein,
karbohidrat) serta kloroform.
• Setelah 15 menit. Tube dikeluarkan dari centrifuge. Akan terlihat 3 lapisan dari hasil
centrifuge. Karena DNA bersifat ringan, maka DNA berada dilapisan paling atas
(supernatant). Lapisan kedua berbentuk padatan, berisi material padat hasil lisis sel
(debris). Misalnya serpihan dinding sel yang rusak. Sedangkan lapisan paling bawah adalah
kloroform yang larut dengan kloroform (warnanya hijau).
Tahap Ekstraksi
• Pada tahan ekstraksi DNA, sering kali digunakan chelating agent seperti ethyenediamine
tetracetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim Dnase yang dapat
mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuclease dengan cara
mengikuti ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim Dnase
dengan cara dikocok berulang kali.
 Tahap Purifikasi
Purifikasi DNA dari kontaminan protein digunakan
enzim protease yaitu pronase atau proteinase-k, dan
kontaminana RNA dengan menggunakan Rnase.

Penambahan Rnase berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA dan

diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. hal tersebut bertujuan untuk
mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperature.
Bahan
Yang Permunian (purifikasi) DNA bertujuan untuk menghilangkan beberapa
digunakan: kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga
protein. Permurnian dari kontasminan protein dan RNA dilakukan
mengguanakan senyaw kloroform isoamyl alcohol, asam asetat, dan enzim
Rnase. Senyawa kloroform isoamilalkohol dan asam asetat berfungsi
mendenaturasi protein sedangkan enzim Rnase berfungsi melisiskan RNA
dari ekstrak DNA tersebut.
Tahap Sentrifugasi
• Tahap selanjutnya yaitu tabung disentrifugasi Kembali pada kecepatan 6.000 rpm
selama 15 menit. Hasil yang didapat yaitu berupa supernatant yang bening dan
pellet (endapan DNA murni) yang berwarna putih terdapat pada dasar tabung dan
penambahan senyawa etanol. Etanol memiliki sifat hidrofilik.
• Kamudian supernatan tersbut dibuang karena DNA berada pada bagian natan.
DNA murni yang dihasilkan adalah DNA yang terbatas dari campuran material
dan komponen intraceluler yang mengandung larutan kompleks barupa RNA,
protein, lemak, dan karbohidrat.
Tahap Prepitasi
• Prepitasi (pemekatan) DNA dilakukan menggunakan isopropanol dingin yang
bertujuan agar DNA tersebut mengendap/mengumpul sekaligus memisahkannya
dari garam-garam mineral sisa CTAB. Pelet hasil prepitasi oleh isopropanol ini
dibersihkan menggunakan alcohol 70%. Pemurnian ini merupakan tahapan paling
penting dari isolasi DNA. Karena bila ada kontaminan selain DNA maka hasil
isolasi DNA yang dilakukan dianggap gagal. Kontaminasi ini dapat menurunkan
kualitas DNA hasil isolasi dan mengakibatkan data yang didapat tidak valid.