II.

DASAR TEORI

Komponen utama kromosom organisme eukariota adalah DNA dan protein histon. DNA bersifat
asam sedangkan protein histon bersifat basa. DNA merupakan bahan genetik sebab informasi biologi
terkandung di dalamnya. DNA terdiri dari gula pentosa (Dioksirobosa), asam fosfat dan pasangan basa
nitrogen (purin dan pirimidin). DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan
tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan
kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA
genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari
mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA
penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein
tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk
sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA
sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom.
A. Isolasi DNA kromosom
DNA pada prinsipnya dapat diisolasi dari berbagai sumber, anatara lain darah, organ tubuh,
daging, serangga, daun dan sebagainya. Pada individu yang sama, DNA yang diperoleh dari berbagai
sumber, akan memiliki jenis, jumlah dan ukuran yang sama. Untuk memperoleh isolat DNA dari sampel,
ada beberapa hal yang perlu diperhatikan yaitu :
1.

Pemecahan dinding sel dan membran inti , dapat dilakukan dengan 2 cara :

a.

Secara fisik, yaitu pemecahan sel dengan cara resonansi atau kekuatan mekanik

b. Secara kimia, yaitu dengan cara buffer lisis yang dapat merusak integritas barier dinding dan
membran sel, contohnya lisosim, EDTA, Tris-Hcl, SDS
2.

Pemisahan larutan DNA dari debris dengan cara centrifuge

3. Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA yang murni menggunakan proteinase-K atau
RNAse
4.

Presipitasi DNA dengan etanol yang dingin

5.

Pemurnian DNA dari ekstrak sel, dapat menggunakan larutan fenol, isopropanol.

6.

Melarutkan pelet DNA dengan buffer TE normal ddH2O

B.

Isolasi DNA plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di
pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA
kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan
prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan
DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein
diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan
dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa

dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya
DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.
Isolasi DNA darah bisa menggunakan protokol FBI. Sapel darah yang telah dibekukan pada suhu -700 C
pada EDTA vacutainer tubes dicairkan, setelah itu ditambahkan sitrate buffer standart ditambah,
dicampur dan tabung disentrifuse. Supernatanya dibuang, dan penambahan buffer ditingkatkan,
dicampur dan disentrifus lagi. Setelah supernatan dibuang, pelet dilarutkan kembali pada larutan
detergent SDS dan proteinase K, dan campuran diinkubasi pada 550 C selama satu jam. Sampel
kemudian diekstrak fenol sekali dengan menggunakan phenol/chloroform/isoamyl alcohol
solution.Setelah sentrifugasi, lapisan berair dibersihkan dari tabung mikrosentrifuse. DNA merupakan
precipitate dari ethanol, dilarutkan kembali pada buffer kemudian dipresipitasi dua kali. Pertama kali
pengeringan pelet, buffer ditambah dan DNA diinkubasi pada suhu 550 C semalaman, larutan DNA diuji
dengan menggunakan polymerase chain reaction.
C.

Isolasi RNA

RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Jumlah populasi mRNA
akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan
menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan
enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA.
Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses
penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan
pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah
dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan
purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari
komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah
berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA
(ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel
dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun
mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis
deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk
menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul
nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan
menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan
choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase
digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau
purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi
memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan
ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA)
dan menempel di dasar tabung ependorf.
Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar lebih efisien,
isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu sampel darah total (whole blood)
yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan

buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Setelah disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi
tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas merupakan serum, lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel
darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel
darah putih diambil dengan klinipette.
Isolasi DNA darah bisa menggunakan protokol FBI. Sapel darah yang telah dibekukan pada suhu -700 C
pada EDTA vacutainer tubes dicairkan, setelah itu ditambahkan sitrate buffer standart ditambah,
dicampur dan tabung disentrifuse. Supernatanya dibuang, dan penambahan buffer ditingkatkan,
dicampur dan disentrifus lagi. Setelah supernatan dibuang, pelet dilarutkan kembali pada larutan
detergent SDS dan proteinase K, dan campuran diinkubasi pada 550 C selama satu jam. Sampel
kemudian diekstrak fenol sekali dengan menggunakan phenol/chloroform/isoamyl alcohol
solution.Setelah sentrifugasi, lapisan berair dibersihkan dari tabung mikrosentrifuse. DNA merupakan
precipitate dari ethanol, dilarutkan kembali pada buffer kemudian dipresipitasi dua kali. Pertama kali
pengeringan pelet, buffer ditambah dan DNA diinkubasi pada suhu 550 C semalaman, larutan DNA diuji
dengan menggunakan polymerase chain reaction.