LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PANGAN

EKSTRAKSI DNA

Dosen : Dr. Titik Budiati, S.TP, MT, M. SC

Teknisi : 1. Aji
2. Widya Rahhmawati., S.Si

Disusun oleh:
THARISMA KHAIRUNNISA (B41220611)
Golongan A/20

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI REKAYASA PANGAN

JURUSAN TEKNOLOGI PERTANIAN
POLITEKNIK NEGERI JEMBER
2024
 Bab 1 Pendahuluan
1.1 Latarbelakang
Ekstraksi DNA adalah suatu proses pemisahan DNA dari komponen-
komponen sel lainnya. Ekstraksi DNA pada organisme eukariot dilakukan melalui
proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan
RNA (cell digestion), dan pengendapan DNA (precipitation). DNA larut dalam
air, tapi tidak larut dalam air asin. Perbedaan dalam tingkat kelarutan DNA inilah
yang akhirnya menjadi dasar dalam proses ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA
merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai
berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung. DNA ditemukan pada semua makhluk hidup dari
mikroorganisme sampai organisme tingkat tinggi, misalnya manusia, hewan, dan
tumbuhan. DNA terdapat dalam sel dan inti sel. DNA dapat diekstraksi dari segala
macam organ yang terdapat pada bagian tubuh makhluk hidup bersel, misalnya
tumbuhan dapat diekstraksi dari daun, buah ataupun batangnya (Muladno, 2002).
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah. Presipitasi
dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Pada praktikum
kali ini, kami akan mengisolasi DNA dengan metode sederhana dengan
menggunakan sampel daging buah stroberi. Pada percobaan ini stroberi digunakan
sebagai bahan untuk mengekstraksi DNA. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan
berbagai metode, baik konvensional maupun menggunakan kit. Ekstraksi DNA
secara konvensional bisa dilakukan antara lain dengan metode CTAB/NaCl.
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam proses
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi
total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi
jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan
substansi dasar lainnya. Ekstrak sel kemudian dipurifikasi sehingga dihasilkan
pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prisnsip utama dalam isolasi DNA
ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA). Begitu pentingnya
pengetahuan tentang ekstraksi/ isolasi DNA, sehingga menjadi suatu kewajiban
bagi mahasiswa jurusan biologi untuk mempelajarinya Berdasarkan pemaparan
diatas, maka pada praktikum kali ini akan dilakukan ekstraksi DNA pada kultur
cair actinomycetes yang berumur 7 hari dengan metode Joo-Won-Sun 2004.

1.2 Tujuan
 Mengetahui proses ekstraksi DNA pada bakteri E-coli
 Bab 2 METODOLOGI PRAKTIKUM
2.1 Alat dan Bahan
 Alat :
1. Erlenmeyer
2. Tup
3. Tip
4. Mikro pipet
5. Microsentifugie
6. Inkubator
 Bahan :
1. E-coli
2. Nuclei lysis solution
3. Rnase
4. Protein preciption
5. Isopropanol
6. Etanol 70%
7. Rehydration solution
2.2 prosedur kerja
1. Kultur cair diinokulasi ke dalam 5 mL Lb merck darmstadt dan di inkubasi
dengan pengaduk orbital shaker pada suhu 37°C selama 16-18 jam
2. Kultur cair diambil sebanyak 1.5 mL disentrifugasi selama 2 menit pada
13000-16000 x g hingga memperoleh pelet
3. Supernatan dibuang
4. Ditambahkan +600 ml nudei lysis solution. Kemudian dihomogenisasi
dengan pipet
5. Di inkubasi selama 5 menit dengan suhu 80°C kemudian dinginkan hingga
suhu ruang
6. Ditambahkan + 3 mL RNase pada cell lysate lalu bolak balik tube untuk
proses pencampuran
7. Di inkubasi 15 menit dengan suhu 37°C
8. Ditambahkan 200ml protein presipitation
9. Di inkubasi di es dengan waktu 5 menit kemudian sentrifugasi selama 3
menit
10. Supernatan dipindahkan ke microcentrifuge tube bersih yang sudah diisi
isopropanol 600 ml kemudian setrifugasi pada 13,000-16,000 selama 2
menit
11. Ditambahkan 600 ml etanol 70%
12. Di sentrifugasi 2 menit kemudian dibiarkan etanol menguap selama 10
menit
13. Tambahkan rehydration solution 100 ml lalu inkubasi pada suhu 65°C
 Bab 4 PEMBAHASAN

4.1 Jelaskan arti DNA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan
pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan
bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari
materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan
(Suryo, 2010). DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan
pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin
dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki
struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin
(T) yang memiliki struktur cincin tunggal. Ketika guanin berikatan dengan sitosin,
maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan
dengan timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen
pembangun (building block). DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat
dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Faatih, 2009). Ekstraksi DNA
merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. Masalah-masalah dalam
ekstraksi DNA masih merupakan hal penting yang perlu diatasi. Jumlah dan
kualitas DNA hasil ekstraksi bervariasi tergantung dari spesies tanaman sehingga
mempengaruhi analisis lebih lanjut seperti hibridisasi DNA, pemotongan DNA
dengan enzim restriksi maupun analisis dengan polymerase chain reaction (PCR)
(Pharmawati, 2009).

4.2 Jelaskan maksud setiap ekstraksi DNA

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis
dinding dan membran sel; (3)Ekstraksi dalam larutan; (4)Purifikasi; dan
(5)Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut
dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan
kecepatan yang bervariasi.
Kultur cair salmonella sp. Diinokulasikan ke dalam 5 mL luria bertani dan di
inkubasikan dengan pengaduk orbital shaker pada 37°C selama 16-18 jam.
Kemudian kultur diambil 1.5 mL disentrifugasi selama 2 menit hingga
memperoleh pelet. setelah didapatkan pelet kemudian supernatan dibuang dan
disuspensikan dengan menambah nudei lysis solution lalu dihomogenisasikan
dengan menggunakan mikropipet secara perlahan, fungsi penambahan lysis
solution adalah Lysis solution mengandung bahan kimia seperti deterjen atau
larutan garam yang mengganggu membran sel bakteri, membuka sel dan
melepaskan konten seluler, termasuk DNA. Kemudian ditambahkan Rnase pada
lysis solutin lalu homogenisasikan secara bolak balik kemudian di inkubasi
selama 15 menit. Tujuan utama penambahan Rnase, RNA: RNase bertugas untuk
menghancurkan RNA yang terdapat dalam sampel, sehingga hanya DNA yang
tetap utuh dan dapat diekstraksi. Ini penting karena dalam beberapa aplikasi,
seperti PCR (Polymerase Chain Reaction) atau analisis elektroforesis, keberadaan
RNA dapat mengganggu atau menghasilkan hasil yang salah. RNAse
ditambahkan kedalam suspensi yang berfungsi untuk menghancurkan RNA
sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh dan di inkubasi. Lysis solution
ditambahkan dengan tujuan untuk merusak dinding sel bakteri kemudian di
homogenkan di vortex. Setelah homogen ditambahkan etanol untuk mengikat
strand DNA yang telah terkumpul. Strand-strand DNA yang terikat oleh etanol
akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung diatas filtrat. Selain itu
etanol juga berfungsi mempertifikasi DNA. Pemekatan dengan etanol pada
lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedua
larutan. Pellet dipindahkan ke dalam spin kolom yang telah dimasukkan dalam
collection tube, hal ini bertujuan untuk memisahkan kontaminan yang mungkin
masih terdapat pada supernatan. Kemudian tambahkan DNA rehydration solution
dalam tube dan lakukan rehidrasi pada DNA dengan menginkubasi pada suhu
65°C

4.3 jelaskan bahan kimia yang dipakai pada setiap tahap ekstraksi DNA
Nuclei lysis solution : berfungsi untuk menghancurkan membran nukleus
bakteri Salmonella typhi dan sel lainnya. Nuclei lysis solution adalah larutan yang
digunakan untuk melarutkan inti (nukleus) sel-sel eukariotik dalam proses
ekstraksi DNA. Larutan ini biasanya mengandung bahan-bahan yang berfungsi
untuk menghancurkan membran inti (nukleus) dan mengeluarkan DNA dari
dalamnya. Komponen utama dalam nuclei lysis solution seringkali termasuk
deterjen seperti SDS (sodium dodecyl sulfate) yang memecah membran sel dan
inti, serta garam dan buffer untuk menjaga kondisi larutan yang sesuai untuk
pelepasan DNA.
RNAse pada umumnya untuk menghilangkan RNA pada larutan DNA.
RNAse merupakan enzim pendegradasi RNA. Prinsip kerja RNAse adalah
memotong ikatan fosfodiester antara 5'-ribosa dari nukleotida dan gugus
fosfatyang melekat pada 3'-ribosa, yang kemudian dihidrolisis membentuk 3'-
nukleosida fosfat (Sambrook et al., 1989). Fungsi utama RNase dalam ekstraksi
DNA adalah untuk menghilangkan RNA yang dapat mengganggu dalam analisis
DNA.
 Protein precipitation solution : berfungsi untuk menggumpalkan protein
atau sisa sisa sel Salmonella typhi dan sel lainnya setelah penghancuran.
- Isopropanol : berfungsi untuk memurnikan DNA dari sisa-sisa sel yang
masih tersisa. - Ethanol : berfungsi untuk presipitasi DNA Salmonella typhi dan
DNA lainnya.
Etanol 70% berperan dalam pemurnian DNA, garam-garam yang terlibat
dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat
terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan
etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam.
- DNA rehydration solution : berfungsi untuk merehidrasi atau
mengendapkan DNA

4.4 Jelaskan reaksi yang terjadi antara bahan kimia terhadap reaksi yang
terjadi pada proses ekstraksi DNA
Proses ekstraksi DNA melibatkan serangkaian reaksi kimia yang penting
untuk memisahkan dan mengisolasi DNA dari sel-sel atau jaringan yang ada
dalam sampel. Beberapa reaksi kimia seperti :
Pelunakkan (lysis) Larutan ini biasanya mengandung bahan-bahan yang
berfungsi untuk menghancurkan membran inti (nukleus) dan mengeluarkan DNA
dari dalamnya. Komponen utama dalam nuclei lysis solution seringkali termasuk
deterjen seperti SDS (sodium dodecyl sulfate) yang memecah membran sel dan
inti, serta garam dan buffer untuk menjaga kondisi larutan yang sesuai untuk
pelepasan DNA.
Pemisahan (Separation):
Pada tahap ini, reaksi kimia terjadi melalui sentrifugasi. Sentrifugasi
memanfaatkan prinsip gaya sentrifugal untuk memisahkan komponen seluler
berdasarkan berat molekulnya. Ini memungkinkan pemisahan antara supernatan
(yang mengandung DNA) dan pellet sel-sel yang telah pecah.

Presipitasi (Precipitation):
Reaksi kimia yang terjadi pada tahap ini adalah penambahan alkohol, seperti
etanol atau isopropanol, ke dalam supernatan DNA. Alkohol ini membantu
mengendapkan DNA, yang akan membentuk gumpalan yang dapat dipulihkan
setelah sentrifugasi.

Pembersihan (Purification):
Tahap ini melibatkan reaksi kimia dengan menggunakan larutan pencuci, seperti
etanol 70% atau larutan garam rendah. Larutan ini membantu menghilangkan
garam, deterjen, dan kontaminan lainnya dari sampel DNA, sehingga memurnikan
DNA yang dihasilkan.
 Pengendapan Kembali (Resuspension):
Reaksi kimia yang terjadi di tahap ini adalah pembubaran gumpalan DNA yang
telah diendapkan dalam larutan yang sesuai, seperti air atau larutan buffer DNA.
Hal ini membentuk larutan yang homogen dan siap digunakan dalam berbagai
aplikasi analisis molekuler.

4.4 bagaimana cara menghitung konsentrasi DNA yang anda hasilkan

Teknik yang paling umum untuk menentukan hasil dan kemurnian DNA adalah
pengukuran serapan. Meskipun dapat dikatakan bahwa pengukuran fluoresensi
lebih mudah, pengukuran serapannya sederhana, dan memerlukan peralatan
laboratorium yang tersedia secara umum. Yang diperlukan untuk metode
absorbansi hanyalah spektrofotometer yang dilengkapi dengan lampu UV, kuvet
transparan UV (tergantung instrumennya) dan larutan DNA yang telah
dimurnikan. Pembacaan penyerapan dilakukan pada 260nm (A 260 ) dimana DNA
menyerap cahaya paling kuat, dan angka yang dihasilkan memungkinkan
seseorang memperkirakan konsentrasi larutan. Untuk memastikan angka-angka
tersebut berguna, pembacaan A 260 harus berada dalam rentang linier instrumen
(umumnya 0,1–1,0).

Konsentrasi DNA diperkirakan dengan mengukur serapan pada 260nm,

menyesuaikan pengukuran kekeruhan A 260 (diukur dengan serapan pada
320nm), mengalikannya dengan faktor pengenceran, dan menggunakan
hubungan bahwa A 260 sebesar 1,0 = 50µg/ml dsDNA murni.

Konsentrasi (µg/ml) = ( Bacaan 260 – Pembacaan 320 ) × faktor pengenceran ×

50µg/ml

Hasil total diperoleh dengan mengalikan konsentrasi DNA dengan total volume
sampel akhir yang dimurnikan.

Hasil DNA (µg) = konsentrasi DNA × total volume sampel (ml)

Namun, DNA bukanlah satu-satunya molekul yang mampu menyerap sinar UV

pada 260nm. Karena RNA juga memiliki daya serap yang besar pada 260nm, dan
asam amino aromatik yang ada dalam protein menyerap pada 280nm, kedua
kontaminan tersebut, jika ada dalam larutan DNA, akan berkontribusi pada
pengukuran total pada 260nm. Selain itu, kehadiran guanidin akan menghasilkan
serapan 260nm yang lebih tinggi. Artinya, jika angka A 260 digunakan untuk
penghitungan hasil, kuantitas DNA mungkin terlalu tinggi.

Untuk mengevaluasi kemurnian DNA, ukur serapan dari 230nm hingga 320nm
untuk mendeteksi kemungkinan kontaminan lainnya. Perhitungan kemurnian
yang paling umum adalah rasio serapan pada 260nm dibagi dengan pembacaan
pada 280nm. DNA berkualitas baik akan memiliki rasio A 260 /A 280 sebesar 1,7–
2,0. Pembacaan 1,6 tidak membuat DNA tidak cocok untuk aplikasi apa pun,
namun rasio yang lebih rendah menunjukkan lebih banyak kontaminan yang
ada. Rasionya dapat dihitung setelah koreksi kekeruhan (absorbansi pada
320nm).

Kemurnian DNA (A 260 /A 280 ) = (Bacaan A 260 – Pembacaan A 320 ) through

(Bacaan A 280 – Pembacaan A 320 )

Absorbansi yang kuat sekitar 230nm dapat menunjukkan bahwa senyawa organik
atau garam chaotropic terdapat dalam DNA yang dimurnikan. Rasio 260nm
hingga 230nm dapat membantu mengevaluasi tingkat sisa garam dalam DNA
yang dimurnikan. Semakin rendah rasionya, misalnya semakin besar jumlah
garam tiosianatnya. Sebagai pedoman, A 260 /A 230 paling baik jika lebih besar
dari 1,5. Pembacaan pada 320 nm akan menunjukkan apakah terdapat kekeruhan
dalam larutan, yang merupakan indikasi lain kemungkinan kontaminasi. Oleh
karena itu, mengambil spektrum pembacaan dari 230nm hingga 320nm adalah
yang paling informatif.
 Bab 5 kESIMPULAN
5.1 kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa
isolasi DNA bakteri Escherichia coli memiliki prinsip utama yaitu sentrifugasi
dan presipitasi. Isolasi DNA memiliki 3 tahap yaitu pengahancuran atau lisis sel,
tahap ekstraksi dan tahap pencucian.
 DAFTAR PUSTAKA
Faatih, Mukhlissul. 2009. Isolasi Dan Digesti Dna Kromosom. Jurnal Penelitian
Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009: 61 - 67.
Pharmawati, Made. 2009. Optimalisasi Ekstraksi Dna Dan Pcr-Rapd Pada
Grevillea spp. (Proteaceae). Jurnal Biologi XIII (1) : 12 -16.
Suryo. 2010. Genetika Manusia. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.

Sambrook J, Fritsch F, Miniatis T. 1989. Molecular Cloning Laboratory Manual.

3rd edition. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr.
Anandika Dhaliwal. 2013. DNA Extraction and Purification. Rutgers University,
New Jersey, United States. Publish: 2008 Taken: February 21th 2019.
DOI//dx.doi.org/10.13070/mm.e n.3.191. https://www.labome.com/metho
d/DNA-Extraction-andPurification.html 17.
Tushar Chauchan. 2018. Different types of dna extraction methods. Publish:
October 21th 2018 Taken: February 21th 2019.
http://geneticeducation.co.in/diff erent-types-of-dna-extractionmethods/