Central Dogma of Molecular Biology

Putra Aji Pratama, S.P.

MK. Bioteknologi Pertanian
TA. 2023 - 2024
- DNA berisi informasi genetik lengkap yang
mendefinisikan struktur dan fungsi suatu organisme.
- Protein dibuat menggunakan kode dari DNA
- Terdapat tiga proses utama yang bertanggung jawab
atas pewarisan informasi genetik dan konservasinya
dari satu bentuk ke bentuk yang lainnya.
1. Replikasi → asam nukleat diduplikasi untuk
menghasilkan salinan identik
2. Transkripsi → segmen DNA yang membentuk
satu gen ditranskripsi menjadi urutan RNA
untai tunggal.
3. Translasi → Rangkaian RNA diterjemahkan
menjadi asam amino
Apa itu DNA?

- Nukleotida merupakan bahan pembangun DNA

yang disebut dengan deoksinukleosida trifosfat
(dNTP) yang terbuat dari tiga bahan utama yaitu
basa nitrogen, molekul gula, dan trifosfat. Macam
nukleotida:
1. dATP → deoksiadenosin trifosfat
2. dGTP → deoksiguanosin trifosfat
3. dTTP → deoksitimidin trifosfat
4. dCTP → deoksi sitidin trifosfat
Apa itu DNA?

- DNA dibentuk dengan menggabungkan nukleotida antara

gugus fosfat dari nukleotida (terletak pada atom C ke lima
molekul gula) dengan hidroksil (atom C ke 3) pada
molekul gula nukleotida sebelumnya.
- Untuk mencapai hal ini, difosfat molekul terpecah
(melepaskan energi).
- Artinya nukleotida baru selalu ditambahkan pada rantai
sisi 3’
DNA Dalam Sel

ORGAN MANAKAH YANG MENGANDUNG DNA?

- Sel eukariotik mengandung beberapa organel

sel yang mengandung sebagian besar DNA
dalam sel dan disebut dengan DNA kromosom.
DNA ini dipisahkan dari sitoplasma oleh lapisan
membran ganda
- Mitokondria juga mengandung DNA yang
disebut dengan DNA mitokondria.
- Sel eukariotik yang mampu melakukan
fotosintesis, umumnya mengandung kloroplas
(terdapat DNA Kloroplas).
DNA dalam Sel

Terdapat tiga jenis gen:

1. Gen pengkode protein → gen ini di transkripsi menjadi RNA dan

kemudian diterjemahkan menjadi protein
2. Gen penentu RNA → hanya di transkripsi menjadi RNA
3. Gen pengatur → mencangkup gen yang tidak di transkripsi pada
untaian.
- Gen yang mengkode DNA ribosomal (rDNA) berperan penting dalam sintesis protein. Dalam sel
eukariotik terdapat 50 - 5000 salinan gen identik yang menentukan dalam proses sintesis protein
ini. Gen ini disusun secara tandem pada satu atau lebih kromosom dan dipisahkan satu sama lain
oleh non transcriber spacer (NTS).
- Gen ditranskripsi menjadi prekursor RNA, rRNA dilepaskan melalui pembelahan dan proses ini
menghilangkan external transcript spacer (ETS), internal transcript spacer 1 (ITS 1), dan internal
transcript spacer 2 (ITS 2) dari prekursor RNA dan menghasilkan 3 molekul rRNA (kode: 18S, 5.8S,
28S)
Persiapan gDNA

- Dalam sel eukariotik, DNA dapat diisolasi pada tiga tempat utama (nukleus, mitokondria, dan
kloroplas). Semua penghalang (debris) harus dihilangkan dalam proses ekstraksi DNA. Terdapat
tiga fase dalam proses ini
1. Fase aquos → DNA dapat diendapkan dengan etanol
2. Fase interfase → denaturasi protein
3. Fase fenol → protein dan lemak terlarut
- Setelah DNA didapatkan maka dapat diukur kualitas dan kuantitasnya. DNA yang digunakan dalam
posisi yang baik, selain itu dibuang. Melihat kualitas DNA bisa dilakukan dengan metode
elektroforesis. memperbanyak DNA menggunakan metode PCR.
Isolasi DNA

- Konsepnya memisahkan DNA yang terdapat didalam sel dari protein, membran, serta materi sel
lainnya yang terdapat dalam sel tersebut.
- Bertujuan untuk mendapatkan DNA murni tanpa campuran apapun (debris).
- DNA yang telah didapatkan dapat digunakan untuk analisis lanjutan sesuai dengan tujuan tertentu.
Kegiatan isolasi DNA di era modern dapat dilakukan oleh robot dengan program khusus.
- Banyak cara yang dapat dilakukan untuk mengisolasi DNA, tidak hanya terpaku pada satu SOP
saja. Karena setiap laboratorium memiliki SOP sendiri dalam melakukan isolasi, dan dipersilahkan
melakukan analisa sesuai dengan kebutuhan.
- Tahapan dalam isolasi DNA: Pengambilan sampel, lisis (penghancuran), presipitasi (pemisahan), dan
purifikasi (mendapatkan DNA murni).
1. Pengambilan Sampel DNA dan Lisis

- Tujuannya adalah mengambil sampel DNA genome, semua copy DNA di setiap sel dalam sebuah
individu bersifat sama, jadi pengambilan dapat dilakukan dari seluruh bagian dari tanaman. Namun
yang paling mudah adalah pada daun, karena bersifat lunak dan mudah didapatkan. Sehingga
mudah untuk proses lisis.
- Cara mengambil DNA adalah merusak sel tanaman tanpa merusak struktur DNA, metode ini
disebut lisis. Cara fisikal yang mudah adalah menggunakan mortar dan pistil ditambahkan dengan
nitrogen cair. Cara lain dengan menggunakan bahan kimia yaitu penggunaan zirconium bends
ditambahkan dengan precellys
3. Presipitasi (Pemisahan)

- Setelah dilakukan proses lisis

(penghancuran), pada tahap ini DNA
akan dipisahkan dengan debris (RNA,
protein, dan lainnya).
- Pemisahan dilakukan menggunakan
Kloroform dan atau Phenol
extraction. Pemilihannya disesuaikan
dengan kecocokan antara pemisah
dan sampel yang akan dipisahkan.
- Hasil akhir yang ada di tube adalah DNA, RNA (bagian debris) dan debris
lain (bawah). Apabila pada tahap lisis ditambahkan RNAse (mendegradasi
RNA), maka hanya RNA saja yang tersisa.
- Selanjutnya diambil bagian DNA (permukaan atas) dan dipindahkan ke
tube lain untuk dilakukan tahap purifikasi.
4. Purifikasi (Mendapatkan DNA Murni)

- Istilah bioteknologi untuk mendapatkan

molekul DNA murni untuk dilakukan analisa
lanjutan sesuai dengan tujuannya disebut
dengan purifikasi atau elution.
- Tahap purifikasi dilakukan dengan
menambahkan isopropanol dingin (storage
-20 celc) dan dimasukkan ke tube yang telah
berisi pelet DNA (telah melalui proses
presipitasi). Lakukan inkubasi dengan suhu
-20 cels, dan melakukan proses sentrifugasi.
 - Buang supernatan dan dilakukan pencucian pada DNA pelet.
- Pencucian dilakukan 2X dengan ketentuan:
1. Ethanol 80%, sentrifuge, dan buang supernatannya
2. Ethanol 100%, sentrifuge dan buang supernatan
- Air Dry dengan tujuan untuk menghilangkan sisa etanol, dan dapat
ditambahkan H2O/TE buffer dengan tujuan untuk menyimpan DNA
- Penyimpanan DNA murni hasil purifikasi dengan suhu -20 cels untuk
penyimpanan jangka pendek, dan -80 cels untuk penyimpanan jangka
panjang.

Kenapa demikian?
Prinsip PCR

- Polymerase Chain Reaction (PCR) bertujuan untuk membuat salinan suatu gen dalam jumlah besar
dalam waktu relatif singkat. Hal ini ini diperlukan untuk memiliki template awal yang cukup untuk
dilakukan proses elektroforesis.
- Terdapat tiga langkah utama dalam proses PCR yang dapat diulang selama 30 hingga 40 kali dalam
satu siklus. Hal ini dilakukan secara otomatis dalam hal memanaskan dan mendinginkan tabung
dengan campuran reaksi tertentu dalam kurun waktu yang sangat singkat.
- Proses dalam PCR meliputi denaturation, annealing, dan extension.
Tahapan PCR

1. Denaturation → terjadi pada suhu 94℃ dengan cara

membuka untaian rantai ganda menjadi rantai tunggal.
2. Annealing → terjadi pada suhu 54 ℃, terjadi penempelan
primer dan mulai menyalin template.
3. Extension → terjadi pada suhu 72 ℃, terjadi penggabungan
beberapa basa, terjadi untai ganda kembali.

- terjadi peningkatan eksponensial dalam jumlah salinan gen

Apakah Salinan Gen Ukurannya Tepat?

- Analisa yang dapat dilakukan setelah DNA sudah diperbanyak menggunakan metode PCR adalah
menentukan kualitas salinan.
1. Melihat produk yang terbentuk → melihat kemungkinan kualitas DNA yang buruk,
kecocokan primer yang digunakan, jumlah templat awal terlalu banyak, dan lainnya.
2. Ukuran produk → ada kemungkinan ukuran tidak sesuai dengan templat awal, ukuran yang
tidak sesuai biasanya disebabkan oleh primer yang digunakan tidak cocok, penempelan
primer yang tidak sesuai dengan seharusnya.
3. Hanya terbentuk satu pita → primer tidak menempel pada basa nitrogen yang seharusnya,
jadi hasil akhir hanya akan terbentuk satu pita saja.
Perhatikan gambar disamping pada masing-masing jalur!

- Jalur 1 → Panjang fragmen PCR kira-kira 1850 bp.

- Jalur 2 dan 4 → panjang pecahan 800 bp.
- jalur 3 → PCR gagal, tidak terbentuk produk
- Jalur 5 → beberapa pita terbentuk karena salah satu primer
dipasang pada tempat yang berbeda saat annealing.
Principle of Sequencing

Pertama yang harus diketahui pada prinsip dalam sequencing

adalah mengetahui reaksi pada sequencing itu sendiri.

- Terdapat tiga langkah utama dalam sequencing reaction,

dan tahapan ini mirip dengan PCR dan diulang antara 30
hingga 40 siklus.
1. Denaturasi
2. Annealing
3. Extension
- Perbedaannya adalah pada proses sequencing hanya menggunakan satu primer, maka hanya akan
terdapat satu untaian yang disalin dan terdapat peningkatan secara linier dalam siklus tersebut.
Principle of Sequencing

2. Pemisahan Molekul

- Setelah tahap pertama, memastikan semua untaian yang telah dicopy berakhir pada ddNTP.
dilanjutkan dengan proses elektroforesis. DNA bermuatan negatif akan berpindah ke muatan
positif. Fragmen berukuran kecil akan berjalan lebih cepat, sehingga molekul DNA akan terpisah
sesuai dengan ukurannya.

3. Deteksi pada Sequencer Otomatis

- Fragmen bermigrasi melalui gel melewati sinar laser di bawah bagian gel, Laser mengirimkan
cahaya dengan warna yang berbeda, Cahaya tersebut dikumpulkan ke spektograf. Setiap basa
memiliki warna tersendiri, sehingga sequencer dapat mendeteksi urutan basa pada gen yang
diurutkan
Principle of Sequencing

4. Perakitan Gen

- Dalam tujuan tertentu gen dikonfirmasi kedua arah dengan cara mengurutkan gen maju dan
mundur (750 - 800 bp per proses). Program komputer akan menyatukan bagian yang berbeda dan
menyusun keseluruhan rangkaian gen.
Filogenetik

Bertujuan untuk mengetahui hubungan silsilah

antara kedua atau lebih organisme. Organisme yang
berkerabat dekat memiliki urutan basa nitrogen yang
sama, dan sebaliknya. Ilmu yang dipelajari ini dapat
mengkonstruksi hubungan evolusi antar spesies.
Selain itu juga dapat menduga nenek moyang dari
organisme tersebut.
Terimakasih