Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA merupakan teknik untuk mengeluarkan DNA dari sumber asal,

inti sel atau organel sel (DNA kloroplas, DNA mitokondria). DNA dapat diekstraksi dari

sampel jaringan yang masih segar, beku, dikeringkan atau disimpan dalam alkohol atau

buffer. Untuk mengurangi dampak studi populasi telah dikembangkan prosedur ekstraksi

DNA yang noninvasif, seperti dengan memanfaatkan rambut, tinja dan lainnya. Prosedur

ekstraksi mulai dengan penumbukan mekanik untuk memisahkan sel dan menghancurkan

membran sel dan atau dinding sel, sedangkan untuk inti penuh (budidaya dan jaringan sel

seperti darah tidak membutuhkan tumbukan mekanik).

Jaringan lalu dimasukan di dalam larutan yang mengandung detergen yang melilis

membrane inti, juga proteinase yang mendenaturasi protein lain, terutama nukelase,

tetapi meninggalkan asam nukleat utuh. Protein dipisahkan dari asam nukleat melalui

ekstraksi dengan senyawa organic (biasanya fenol dan kloroform), dan DNA dimurnikan

dari reagen dalam buffer ekstraksi melalui presipitasi alcohol atau dialysis.

Pemisahan mtDNA dan cpDNA dari DNA genom sangat ekstensif prosedurnya,

melibatkan lapisan larutan jaringan pengurai pada gradient sesium klorida adalah subjek

pada sentrifugasi kecepatan tinggi. Pemisahan DNA organel dan inti tidak membutuhkan

untuk banyak prosedur yang mendeteksi marker apakah inti atau organel melalui aplikasi

pelacak tepat atau primer untuk genom total DNA. Protokol ekstraksi rinci telah

dikembangkan untuk banyak jaringan dan jenis DNA spesies berbeda. Pencarian cepat

melalui literature seharunya mengungkap protocol tepat untuk organisme khusus.

Kebanyakan prosedur ekstraksi dilengkapi dalam volume kecil tabung mikrofuge (1.5 mL),

mengfasilitasi penelitian biologi populasi yang membutuhkan sampel dari jumlah besar

individu.
Isolasi DNA dan Gen
Isolasi DNA merupakan teknik dasar yang harus dikuasai dalam teknologi DNA

rekombinan. Tujuan isolasi adalah mendapatkan DNA tanpa debris sel. Organisme tingkat

rendah, seperti bakteri dan lain-lain (sel prokariot), dan mahluk hidup tingkat tinggi, seperti

manusia, hewan, tumbuhan dan lain-lain (sel eukariot) merupakan sumber DNA. Pada sel

eukariot, seperti yang telah dibahas sebelumnya, terdapat DNA di dalam inti sel dan DNA

dalam organel-organel sel lainnya. Teknik isolasi DNA telah dikenal sejak dahulu kala. Salah

satu teknik isolasi adalah secara mini prep (mini-preparation) dan isoalsi DNA secara big

prep (big-preparation).

Beberapa peneliti sering menggunakan kedua teknik ini dengan berbagai modifikasi

yang disesuaikan dengan kondisi lingkungan. Rujukan kedua proses dapat dilihat pada

buku Molecular Cloning Laboratory Manual yang ditulis oleh Sambrok dan kawan-kawan.

Teknik isolasi lain untuk mendapatkan gen/fragmen gen spesifik dapat dilakukan melalui

teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Prinsip teknik isolasi DNA mencakup berbagai

tahap reaksi dengan tujuan yang berbeda-beda setiap tahapnya.

Tahap pertama adalah penghancuran dinding sel. Tahap ini dapat dilakukan secara

mekanis dan secara enzimatis. Cara mekanis yang sering dilakukan adalah teknik sonikasi,

high pressure distruption dan mencairkan dalam keadaan dingin. Sedangkan cara

enzimatis yang umum dilakukan adalah penggunaan lisozim. Saat ini kedua teknik ini

sering digabungkan dengan beberapa modifikasi perlakuan.

Tahap kedua adalah lisis sel. Proses ini dapat dilakukan dalam berbagai cara,

tergantung pada jenis selnya. Sel-sel lunak dapat disuspensi dengan mudah menggunakan

bufer non-osmotik. Sedangkan sel-sel yang kuat dapat dilisis dengan penambahan

detergen yang keras seperti Triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pada sel

eukariot proses ini sering digabung dengan tujuan dapat merusak membran inti tempat

asam nukelat.
 Tahap ketiga adalah membersihkan debris sel. Proses ini sering dilakukan

dengan cara sentrifugasi. Campuran molekul, seperti protein, DNA, dan lain-lain,

merupakan hasil sentrifugasi. Protein dapat dipresipitasi dengan menggunakan fenol atau

solven organik, seperti kloroform dan lain-lain atau proteinnya dihancurkan dengan enzim

proteinase. Pemisahan DNA dapat dilakukan dengan mengambil supernatan cairan hasil

tahap ini dan dapat dipresipitasi dengan penambahan alkohol. Untuk keperluan rekayasa

genetika, ahli rekayasa genetika biasanya menyiapkan paling sedikit dua jenis DNA yang

berbeda, yaitu DNA obyek penelitian dan DNA vektor sebagai perantara. DNA plasmid

merupakan vektor bagi gen berukuran kecil sedangkan DNA fag merupakan vektor bagi

gen yang berukuran besar.

Teknik-teknik yang telah disebutkan di atas dapat digunakan untuk mengisolasi

berbagai jenis DNA tersebut. Bila pada satu organisme terdapat dua jenis DNA, misalnya

DNA kromosom dan DNA plasmid, maka keduanya harus dipisahkan bila hanya ingin

mendapatkan salah satunya. DNA tersebut dapat dipisahkan berdasarkan struktur

tersiernya. DNA plamid mempunyai struktur yang sangat ketat yang dikenal dengan

covalenthy closed circular (ccc). Struktur yang sama juga dimiliki oleh DNA mitokondria.

Sedangkan DNA kromosom mempunyai struktur yang lebih longgar dan mempunyai

ukuran yang sangat panjang. Perbedaan struktur ini dapat digunakan untuk memisahkan

berbagai jenis DNA tersebut melalui proses denaturasi dan pemisahan dengan gradien

densitas sentrifuga. Proses denaturasi pada DNA ccc sangat sukar dan bila terjadi DNA

tersebut akan cepat mengalami renaturasi. Sebaliknya terjadi pada DNA kromosom.

Berdasarkan sifat ini kedua jenis DNA dapat dipisahkan satu dengan yang lain. Pemisahan

melalui gradien densitas sentrifuga, dilakukan karena kemampuan DNA berikatan dengan

EtBr karena struktur DNA kromosom terbuka. Ikatan ini menyebabkan DNA kromosom

menjadi lebih padat. DNA ccc mempunyai struktur tertutup sehingga sukar membentuk

khelat atau berinterkelasi dengan basa di dalam molekul tersebut. Akibatnya struktur DNA

kurang padat.