Nama : MUHAMMAD LUTHFI

NIM : P17334120046
Kelas : 2B
LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI DNA METODE KIT PROMEGA
Hari, tanggal : Rabu, 25 Agustus 2021
Jenis : Isolasi DNA Metode Kit Promega
Metode : Metode Kit Promega
Tujuan :
Mengambil DNA plasmid dari sampel bakteri kloning gen dan komponen lainnya dalam
sampel Untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Prinsip :
Prinsip Isolasi DNA ada tiga yaitu :
1. Penghancuran (lisis)
2. Esktraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, dan
3. Pemurnian DNA

Dasar Teori :
Isolasi DNA adalah tahapan awal yang harus dilakukan dalam berbagai suatu
pemeriksaan analisis DNA. Proses isolasi DNA sangat menentukan hasil pekerjaan selanjutnya.
Isolasi DNA sangat kompleks dan memiliki kemurnian yang tinggi sehingga dibutuhkan
ketelitian dan kehati-hatian dalam pengerjaan nya. Dalam proses ekstraksi DNA untuk
mendapatkan hasil DNA yang berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus
dipenuhi dalam analisis molekuler. Berbagai analisis biologi molekuler memerlukan hasil isolasi
DNA dengan tingkat kemurnian dan kualitas yang baik.
Hasil isolasi DNA harus terbebas dari berbagai kontaminan seperti protein dan RNA agar
tidak menggangu berlangsungnya proses PCR. Oleh karena itu, metode isolasi DNA yang tepat
sangat diperlukan untuk mendapatkan DNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik. Berbagai
teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar sehingga saat ini muncul berbagai
teknik ekstraksi dan purifikasi DNA dalam bentuk kit yang prosesnya akan lebih mudah, cepat,
dan sederhana.
 Isolasi DNA bakteri dimulai dengan melisiskan atau merusak sel bakteri. Proses ini
sangat penting untuk penghancuran struktur protein dan memungkinkan untuk pelepasan asam
nukleat. Bakteri Gram positif memiliki struktur dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang
tebal dan kuat serta asam teikoat, sedangkan bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar
lipopolisakarida dan hanya memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Oleh karena itu, pada
bakteri Gram positif proses perusakan dinding sel bakteri dapat dilakukan dengan menambahkan
lisozim.
Lisozim berfungsi mencerna dinding sel bakteri yaitu dengan cara menghidrolisis lapisan
peptidoglikan yang tebal. Pada bakteri Gram negatif, lisis sel dilakukan hanya dengan
penambahan proteinase K. Proteinase K merupakan enzim hidrolitik yang bekerja memutus
ikatanikatan peptida pada protein. Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan
presipitasi DNA dengan menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Etanol akan melarutkan
bahan-bahan lain selain DNA sehingga ketika dilakukan sentrifugasi DNA akan terpisah dengan
bahan-bahan lain tersebut. Setelah terpisah, DNA dilarutkan kembali dengan bufer TE.
Alat dan bahan :
1. Biosafety cabinet level 2 (BSC level 2)
2. Freezer
3. Vortex
4. Mikrotube
5. Mikropipet
6. Centrifuge
7. Inkubator
8. Sampel darah
9. Selisisolution reagent.
10. Nuklei lysis solution reagent.
11. Protein presipitation solution reagent.
12. Isopropanol.
13. Etanol 70%.
14. DNA rehydration solution reagent.
Prosedur Kerja :
1. Beri label pada sampel
 2. Pipet sebanyak 300 µL darah dan masukkan ke dalam microtube yang sudah diberi label.
3. Masukkan selisisolution reagen sebanyak 900 µL ke dalam microtube. Fungsi dari
penambahan reagen tersebut adalah untuk menghancurkan sel-sel darah.
4. Homogenkan dengan cara bolak-balik selama 3-5 kali sampai campuran tersebut
homogen.
5. Inkubasi microtube selama 10 menit dengan suhu kamar yaitu 25° C.
6. Lalu masukkan ke dalam sentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 20 detik dengan
suhu kamar.
7. Lalu dihilangkan supernatannya, setelah hilang dihomogenkan endapan tersebut dengan
menggunakan vortex.
8. Tambahkan nuklei lysis solution reagent sebanyak 300 µL. Lalu diinkubasi larutan
selama 15 menit dengan suhu 37° C dengan tujuan untuk menghancurkan sisa gumpalan.
9. Homogenkan larutan tersebut dengan vortex.
10. Tambahkan protein precipitation reagent sebanyak 100 µL dan homogenkan di vortex
selama 20 detik.
11. Masukkan ke dalam sentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 3 menit.
12. Membuat microtube baru dan labeli microtube tersebut. Lalu, masukkan isopropanol
sebanyak 300 µL dan masukkan supernatan larutan yang sudah disentrifugasi. Fungsi
dari penambahan isopropanol ialah untuk pengendapan DNA.
13. Sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 1 menit dengan suhu kamar.
14. Menambah larutan etanol 70% sebanyak 300 µL dengan fungsi pencucian serta
pemurnian DNA dari bahan-bahan organik lainnya.
15. Sentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 1 menit dengan suhu kamar. Buang
supernatan dan mengerinkan endapan telungkupkan selama 10-15 menit.

Kelebihan dan Kekurangan :

Kelebihan :
Isolasi DNA ini memiliki kelebihan yaitu lebih kompleks sehingga hasil yang didapatkan
lebih murni.
Kekurangan :
 Isolasi DNA ini memiliki nilai kemurniaan yang tinggi sehingga dalam Langkah
pengerjaaan nya dibutuhkan ketelitian yang tinggi dan tingkat kehati-hatian yang yang serius
dalam pemeriksaan.
Kesimpulan :
isolasi asam nukleat merupakan suatu prosedur untuk memisahkan DNA atau RNA dari
bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Isolasi DNA memiliki tiga prinsip yaitu
penghancuran (lisis), esktraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA.
Tahap isolasi DNA dimulai dari pengambilan sampel, pelisisan membran dan/ atau
dinding sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan pengawetan DNA. Spesimen
untuk isolasi DNA dapat berasal dari darah, jaringan dalam, semen, saliva, akar rambut, urin,
gigi, kultur sel hewan, bakteri, jaringan tumbuhan dan fungi. Salah satu metode yang digunakan
dalam mengisolasi DNA adalah metode kit promega yaitu metode yang menggunakan reagen
selysisolution dalam melisiskan sel-sel darah.
Isolasi DNA menggunakan metode ini memiliki kemurnian yang tinggi Jika
dibandingkan dengan metode yang lain nya metode ini lebih baik karena lebih kompleks.
Kualitas hasil isolasi DNA tergantung pada kualitas spesimen yang digunakan. Hasil isolasi
DNA yang baik diperoleh dengan memurnikan DNA genomik dari sel atau jaringan yang segar.
Jika spesimen tidak dapat segera diproses, perlu dilakukan penyimpanan dengan kondisi khusus
untuk menjaga integritas DNA.

Nama praktikkan : MUHAMMAD LUTHFI