TEKNIK ISOLASI

ASAM NUKLEAT

KELOMPOK 2 :
 A N DR I AN TO
 D I A N S A LE H
 G A B BY M A N TI K
 G L A DY S PAJ E K O
 M O U R EN LA L O N S AN G
 PENDAHULUAN

Salah satu teknik dasar analisis biologi molekuler adalah

teknik amplifikasi Asam Nukleat yaitu Teknik
Polymerase Chain Reaction (PCR).

Sebelum melaksanakan proses PCR, seorang ATLM

penting untuk melakukan teknik isolasi DNA atau RNA
yang benar agar diperoleh sampel DNA atau RNA yang
berkualitas baik.

DNA dan RNA yang diisolasi berasal dari berbagai

sumber baik prokaryot maupun eukaryot.
 Teknik Isolasi DNA

1. Prinsip Isolasi DNA

Isolasi DNA diperlukan dengan tujuan untuk
memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat. Terdapat 3 prinsip utama
dalam isolasi DNA yakni 1). Penghancuran (lisis), 2).
Esktraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat
seperti selulosa dan protein, serta 3). Pemurnian
DNA.
Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari
pengambilan sampel, pelisisan membran dan/atau
dinding sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA,
pemurnian DNA, dan pengawetan DNA.
2. Jenis Spesimen Untuk Isolasi DNA

DNA manusia dan hewan biasanya diperoleh

dari darah dan jaringan dalam. Namun DNA juga
dapat diekstraksi dari semen, saliva, akar rambut,
urin, dan gigi. Selain itu, spesimen untuk isolasi
DNA juga dapat berasal dari kultur sel hewan, ragi,
bakteri, jaringan tumbuhan dan fungi.
3. Reagen Untuk Isolasi DNA

 Metode tradisional untuk mengisolasi DNA

tumbuhan:
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide(CTAB
Reagen : CTAB bufer, etanol 70%, amonium asetat,
kloroform, tris-EDTA, RNase, dan isopropanol.

 Teknik modern isolasi DNA tumbuhan:

teknik Kit (Quick Extract Plant DNA Extraction)
 Isolasi DNA dari spesimen darah
Reagen : larutan pelisis eritrosit, larutan pelisis
leukosit, RNAse, larutan presipitasi protein,
isopropanol, etanol 70%, dan tris-EDTA (TE)
4. Peralatan Untuk Isolasi DNA

 Mesin sentrifugasi
 Tabung sentrifugasi
 Vortex
 Mikropipet + tip dan pipet transfer
 Tube
 Lanset
 Inkubator atau waterbath
 Sarung tangan dan masker
5. Langkah kerja isolasi DNA

a. Isolasi DNA dari spesimen darah

Sample
RBC lysis WBC lysis
preparation

DNA binding

Wash

Elution
 b. Isolasi DNA dari Mikroorganisme (genom bakteri)
isolasi DNA genom (kromosom) bakteri metode boiling
 Tumbuhkan bakteri dalam media LB dalam waktu 12-24 jam
dengan suhu 37 C
 Ambil sebanyak 250 mikron dan masukkan kedalam 0,5/1,5
mL tabung eppendorf
 Sentrifuge 3000 rpm selama 5 menit, buang supernatan,
tambahkan 50 mikron 1x PCR-buffer/TE Buffer
 Tambahkan 1 mikron proteinase k (10mg/mL)
 Bekukan min 1 jam pada -80C agar sel rusak
 Panaskan selama 1 jam pd 60C dan didihkan selama 15 menit
pada 95C (dalam PCR)
 Simpan suspensi DNA yang terbentuk pada -20C atau dapat
digunakan langsung utk PCR.
6. Penyimpanan isolat asam nukleat (DNA)

Penyimpanan larutan DNA dapat disimpan

dalam bentuk aliquot dalam suhu -20C atau -70 C
untuk menghindari kerusakan karena pengulangan
freeze- thawing.
7. Aplikasi isolasi asam nukleat untuk diagnostik isolasi DNA
Mycobacterium tubercolosis metode Sambrooke

Pemanenan

Pelisisan

Isolasi

Pencucian

Pengukuran
konsentrasi

Pengenceran
TERIMA KASIH