Nama : MUHAMMAD LUTHFI

Kelas : D3-2B
NIM : P17334120046
LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI DNA PLASMID
Hari,tanggal : Rabu, 25 Agustus 2021
Judul Praktikum : Isolasi DNA Plasmid
Metode Pemeriksaan : KIT Isolasi DNA plasmid
Tujuan Pemeriksaan :
Untuk mengisolasi DNA plasmid dari bakteri, untuk mengekstrak plasmid dan
memisahkannya dari berbagai komponen selular bakteri lainnya, seperti protein, karbobidrat,
lemak dan lain lain.
Prinsip Pemeriksaan :
Pemisahan komponen sel dan DNA genom dengan DNA plasmid berdasarkan berat
molekulnya. Dinding dan membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel
ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang
murni.
Dasar Teori :
Plasmid DNA adalah DNA ekstrak kromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom
dan bisa ditemukanpada sel hidup. Di dalam satu sel, dapat ditemukan lebih dari satu plasmid
dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak mengkodekan fungsi yang
penting untuk pertumbuhan sel tersebut.
Plasmid adalah materi genetik di luar kromosom (DNA di luarkromosom). Bentuk
plasmid adalah bulat double helix dan ukurannya dari 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada
bakteri, jumlah plasmid berbeda atau tidak ada plasmid. Tidak ditemukan plasmid pada isolat
Bombana yang dapat dilihat dengan melihat hasil isolasi plasmid menggunakan metode preparasi
volume kecil.
Plasmid sebagai vektor kloning sering digunakan untuk memperbanyak gen target yang
mengekspresikan fenotip tertentu seperti kemampuan resistensi terhadap antibiotik, produksi
antibiotik, fermentasi gula, produksi enterotoksin, resisten terhadap logamberat, serta
kemampuan untuk menginduksi tumor pada tanaman.
 Plasmid dalam bakteri secara umum berbentuk DNA rantai ganda sirkuler yang secara
stabil diwariskan ke keturunannya. Akan tetapi ada pula plasmid yang berbentuk linear yang
ditemukan pada beberapa varietas bakteri, seperti Streptomycessp. dan Borrelia burgdorferi.
Plasmid biasanya diisolasi secara langsung dari bakteri untuk mendapatkan isolat murni
sebagai vektor kloning gen. Metode isolasi plasmid memiliki perbedaan dengan metode isolasi
DNA genom. Hal ini dikarenakan 28 konfigurasi plasmid yang sirkuler sehingga plasmid lebih
rentan terhadap tekanan mekanis (penggojogan dengan vorteks) setelah lisis sel. Seluruh tahapan
isolasi plasmid harus dilakukan dengan metode inversi tabung selama beberapa kali. Selain itu,
apabila sel yang lisis dan larutan sel masih lisis tersisa cukup banyak, hasil isolasi plasmid dapat
berkurang.
Alat dan Bahan
Alat :
 Microcentrifuge
 Freezer -20°C
 Mikropipet
 Micro tube 1,5 mL
 Tip
 Biosafety Cabinet Level 2
 Vortex
 Inkubator
 Colletion tube dan
 PDH column

Bahan :
Isolat bakteri yg akan dipanen
Kit isolasi DNA plasmid :
 reagen PD 1
 reagen PD 2
 reagen PD 3
 larutan W1 Buffer
  Nuklein Free Water
 Larutan Wash Buffer
Prosedur Kerja
Tahap 1 panen bakteri
 Siapkan microtube 1,5 ml steril dan beri label
 Tuang isolat bakteri ke dalam microtube
 Sentrifugasi pada kecepatan 16000 x gravitasi selama 1 menit pada suhu ruang
 Keluarkan sampel
 Buang supernatan
 Tuang isolat bakteri ke microtube yangs ama
 Sentrifugasi kembali selama 1menit
 Lakukan langkah ini hingga diperoleh pelet (natan) yang cukup untuk isolasi plasmid
sekitar 5-8mL isolat bakteri
 Buang supernatant
Tahap 2 resuspensi bakteri
 Setelah diperoleh peletyg cukup Tambah kan reagen PD 1 dingin sebanyak 200 mikro
liter
 Vortex hingga pelet larut sempurna
Tahap 3 lisissel
 Tambahkan regaen PD 2 sbnyk 200 mikro liter
 Inverting (bolak-balik) sebanyak 10x untuk homogenisasi
 Jangan di Vortex untuk menghindari camouran DNA
 Inkubasi pada suhu ruang selama 2 menit
Tahap 4
 Netralisasi tambahkan ke-3 sebanyak 300 mikroliter
 Inverting kembali dengan cara bolak-balik sebanyak 10 kali untuk homogenisasi
 Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 16000 kali gravitasi selama 5 menit pada suhu
ruang
 Collection tube dan pdh column
 Beri label agar tidaktertukar
  Tahap ke 5 pengikatan DNA (DNA Binding)
 Keluarkan sampel dari centrifuge
 Ambil larutanbening yang terbentuk
 Pindahkan larutan bening ke PDH column
 Centrifugasi dengan kecepatan 16000 x g selama 30 detik pada suhu ruang
 Keluarkan sampel dari centrifuge
 Buang larutan bening dalam collection tube
 Dan kembalikan collection tube ke PDH column
Tahap 6 Pencucian DNA
 Tambahkan w1 buffer sebanyak 400 mikro liter
 Sentrifugasi dengan kecepatan 16000 x g selama 30 menit pada suhu ruang
 Keluarkan sampel ke pdh column
 Tambahkan wash buffer sebanyak 600 mikro liter
 Buang larutan bening
 Dan kembalikan collection tube ke pdh column
 Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 16000 x g selama 3 menit pada suhu ruang
 Keluarkan sampel dari centrifuge
 Pindahkan pdh column kemicrotube 1,5 ml steril yang baru
Tahap 7 pelarutan DNA
 Tambahkan pelarut (nfw) sebanyak 50 mikro liter
 Tambahkan pelarut (nfw) pas di bagiantengah pdh column
 Inkubasi pada suhu ruang selama kurang lebih 2 menit
 Sentrifugasi dengan kecepatan 16000 x g selama 2 menit pada suhu ruang
 Keluarkan sampel dari centrifuge
 Buang pdh column dan tutup microtube yang berisi dna plasmid
 Dna plasmid siap disekuensing
Kelebihan :
 Memiliki tingkat kemurnian yang tinggi
 Harga lebih murah dan digunakan secara luas
Kekurangan :
 Membutuhkan waktu yang relatif lama
 Hasilnya tergantung jenis sampel
Kesimpulan
Tujuan dari isolasi plasmid adalah untuk mengisolasi DNA plasmid dari bakteri.
Pemisahan plasmid bertujuan untuk mengekstrak plasmid dan memisahkan nya dari berbagai
komponen sel bakteri lainnya (seperti protein, karbohidrat, lemak, dll). Juga dapat memisahkan
komponen seluler dan DNA genom dari DNA plasmid berdasarkan berat molekul. Berat molekul
DNA plasmid sirkular lebih rendah dari DNA genom linier dan komponen seluler lainnya.
Plasmid merupakan molekul DNA ekstrakromosomal yang bereplikasi secara mandiri
dan ditemukan dalam sel prokariot dan eukariot Metode lisis alkali merupakan metode yang
sangat umum untuk isolasi plasmid karena mudah dilakukan, relatif murah, dan reprodusibilitas.
Metode ini dapat dilakukan dalam 50 menit sampai 1 jam.

Nama Praktikan : MUHAMMAD LUTHFI