LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

PRAKTIKUM 2

(ISOLASI PLASMID)

ISLAMIC TECHNOPRENEUR UNIVERSITY

Disusun oleh:

Nama : kiki wahyudi

NIM : 190106027

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH BANDUNG
2021
 PRAKTIKUM 2

ISOLASI PLASMID

I. TUJUAN PERCOBAAN
Mahasiswa dapat memahami cara dan prinsip isolasi materi genetik
II. TEORI DASAR
Plasmid pertama kali diperkenalkan oleh Joshua Lederberg pada tahun
1952. Plasmid merupakan molekul DNA ekstrakromosomal yang memiliki
ukuran bervariasi dari kurang dari 1 kb hingga lebih dari 200 kb. Plasmid
umumnya beruntai ganda, molekul sirkuler, dan tertutup secara kuat dengan
ikatan kovalen. Plasmid dapat diisolasi dari sel bakteri dalam bentuk
superheliks (Sambrook dan Russel, 2001). Struktur plasmid dapat dilihat pada
Gambar 1. (Primrose dkk., 2001).
Plasmid dapat juga ditemukan pada eukariota, seperti khamir. Plasmid
hanya mengandung sedikit gen dan biasanya digunakan oleh bakteri dalam
keadaan tertentu, (Reece dkk., 2011).
III. ALAT DAN BAHAN

3.1 ALAT

No Alat fungsi
.
1 Incubator Untuk menumbuhkan kultur mikroba
atau kultur sel
2 Bsc Sebagai alat ukur perusahaan/sebagai
alat ukur keunggulan kompotitif
yang dimiliki perusahaan anda
3 Mikropipet Alat untuk memindahkan cairan
dalam jumlah kecil secara akurat
4 Sentrifugasi Alat untuk muatan objek atau sampel
dalam kecepatan tinggi
5 Loop Memindahkan biakan
3.2 BAHAN
  Tip
 Mikrotub
 Conical tube (falcon 50 ml)
 Media LB cair
 Antibiotik
 Ethanol absolut
 Kit isolasi plasmid (model: GeneAid High-Speed Plasmid Mini Kit)
 a) PD1 Buffer
 b) PD2 Buffer
 c) PD3 Buffer
 d) Wash Buffer
 e) Elution Buffer
 f) Kolom PD
 g) Tabung Penampung
 h) RNAse A
IV. PROSEDUR KERJA

Kultur
 Pilih satu koloni dari cawan selektif
 digores dan inokulasi kultur starter dengan 2–5 ml media LB yang
mengandung antibiotik selektif yang sesuai.
 Inkubasi selama kurang lebih 12-16 jam pada suhu 37 ° C dengan
pengocokan yang kuat (kurang lebih 300 rpm).
 Gunakan tabung atau labu dengan volume minimal 4 kali volume kultur.

Isolasi plasmid

1. RNase A ditambahkan ke PD1 Buffer kemudian campur dengan cara

diguncang selama beberapa detik. Centang kotak di botol. Simpan
campuran PD1 dan RNase A pada 2-8oC hingga 6 bulan.
2. Tambahkan etanol absolut (lihat label botol untuk volume) ke Wash
Buffer sebelum penggunaan pertama.
3. Panen sel: 1,5 ml kultur sel ditransfer ke mikrotube. Sentrifuga tabung
pada 14-16.000 xg selama 1 menit kemudian buang supernatan. (Jika
menggunakan lebih dari 1,5 ml kultur sel bakteri, ulangi tahapan panen
sel)
4. Resuspensi: Tambahkan 200 μl PD1 Buffer (pastikan RNase A telah
ditambahkan) ke dalam tabung. Resuspensi pelet sel dengan vortex atau
pipetting.
5. Lisis: Tambahkan 200 μl PD2 Buffer (pastikan semua presipitat terlarut),
kemudian campur dengan cara membalik tabung 10 kali. Diamkan pada
suhu udara paling tidak untuk setidaknya 2 menit (jangan melebihi 5
menit) catatan: Jangan vortex untuk menghindari pemotongan DNA
genom.
6. Netralisasi: Tambahkan 300 μl PD3 Buffer dan aduk segera dengan
membalik tabung 10 kali, kemudian sentrifuga pada 14-16.000 xg selama
3 menit.
7. DNA-binding: Letakkan Kolom PD dalam tabung penampung.
Tambahkan supernatant dari langkah sebelumnya, kemudian sentrifuga
pada 14-16.000 xg selama 30 detik. Supernatant pada tabung penampung
dibuang. Letakkan kembali Kolom PD dalam tabung penampung.
8. Pencucian: Tambahkan 600 μl Wash Buffer (pastikan ethanol sudah
ditambahkan) ke dalam kolom PD lalu sentrifugasi pada 14-16.000 xg
selama 30 detik. Supernatant pada tabung penampung dibuang. Letakkan
kembali Kolom PD di tabung penampung.
9. Pengeringan: sentrifuga pada 14-16.000 xg selama 3 menit untuk
mengeringkan matriks kolom. Tabung penampung dibuang. Letakkan
kembali Kolom PD di tabung Mikrotube 1,5 ml yang baru.
10. Elusi: Tambahkan 50 μl elution buffer pada bagian tengah matriks Kolom
PD. •Diamkan selama minimal 2 menit. sentrifuga pada 14-16.000 xg
selama 2 menit untuk mengelusi DNA yang telah dimurnikan.
V. DATA PENGAMATAN

Lane 1 = predominantly dimer of the plasmid

Lane 2 = monomer linear

Lane 3 = plasmid isolation result

Lane 4 - monomer of the plasmid

Lane 5= 1 kb ladder.

VI. DISKUSI PEMBAHASAN

6.1 DISKUSI
1. Plasmid diisolasi secara langsung dari bakteri untuk mendapatkan isolat
murni sebagai vektor kloning gen (Das & Dash, 2015).
2. Secara umum, tahapan isolasi plasmid meliputi pemanenan sel dengan
sentrifugasi, resuspensi sel dengan buffer TE dan buffer lisis I, lisis sel
dengan buffer lisis II, netralisasi dengan buffer lisis III dan pemisahan
 DNA plasmid dengan DNA genom dan komponen sel menggunakan
sentrifugasi.
3. EtBr bertindak sebagai mutagen karena dapat mengikat DNA untai ganda,
sehingga dapat mengubah bentuk suatu molekul yang dipercaya dapat
mengganggu proses biologi yang terjadi pada DNA. Saat bekerja dengan
EtBr, pengguna harus menggunakan jas laboratorium, sarung tangan,
masker, dan pelindung mata, serta saat preparasi dimulai, usahakan
jangan sampai larutan EtBr tertumpah.
4. Tujuan pemilihan kecepatan sentrifugasi pada 14–16.000 xg selama 3
menit untuk mengeringkan matriks Pdcolumn (tujuannya untuk
menghilangkan residuWash buffer).
5. Beberapa metode isolasi plasmid antara :lisis alkali lisis dengan
pemanasan dengan menggunakan microwave dengan kromatografi
metode isolasi plasmid yang biasa adalah lisis alkali dan lisis dengan
pemanasan adalah lisis alkalidan lisis dengan pemanasan adalah beberapa
E.coli seperti HB 10it selnya tidak dapat di lisis dengan pemanasan
(sembbrok dan ruseli,2001) metode lain untuk isolasi plasmid dengan
menggunakan sesium klorida yang sangat mahal dan Toxic serta
memerlukan waktu yang lama sehingga metode ini jarang digunakan dari
metode metode isolasi di atas Metode lisis x merupakan metode isolasi
plasma yang banyak digunakan karena sampel merah dan Resudobilitas
( sambrook dan resull,2001)
6. Metode isolasi DNA menggunakan lysis buffer merupakan metode isolasi
yang menggunakan larutan buffer untuk proses pemecahan selnya. Fungsi
larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses lisis dan
pemurnian. Pada tahap akhir pemberian buffer TE untuk menjaga DNA
terjaga selama penyimpanan (iqbal,2016)
7. Low copy number plasmid, dimana plasmid memiliki kemampuan
replikasi rendah sehingga dalam satu sel hanya mengandung satu atau
beberapa plasmid yang sama saja. Sedangkan high copy number plasmid,
 dimana plasmid memiliki kemampuan replikasi tinggi sehingga dalam
satu sel mengandung banyak plasmid yang sama, hingga ribuan.
8. 1. Sumber DNA
• Sumber DNA untuk isolasi DNA kromosom; bisa dari tanaman,kultur
mikroorganise, atau sel manusia.
• Sumber DNA untuk isolasi DNA plasmid;hanya ditemukan pada
beberapa bakteri
2. Prinsip isolasi DNA
• Prinsip isolasi DNA kromosom yaitu memisahkan DNA kromosom
atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.
• Prinsip isolasi DNA Plasmid yaitu DNA plasmid merupakan wadah
yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di
pisahkan dari DNA kromosom.

6.2 PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini kami melakukan isolasi dna plasmid bakteri. Plasmid
merupakan materi gen yang memiliki kemampuan untuk melakukan replikasi
secara otonom. Ukuran plasmid antara 1 kb-200 kb. Berbeda dengan DNA
genom, DNA plasmid biasanya berbentuk sirkuler dan terdapat bebas di dalam
sitoplasma bakteri Selain itu, DNA plasmid jika diberi penambahan kalium asetat
maupun asetat maka untai ganda DNA akan terlarut, dan pada kondisi Ph-12-125,
DNA plasmid akan mengalami denaturasi namun tidak mengalami fragmentasi.
Pada satu sel bakteri dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang
sangat bervariasi. Pada teknologi DNA rekominan, plasmid digunakan sebagai
vektor untuk menyisipkan DNA yang siklon sehingga perlu diperoleh plamid
yang tidak terkontaminasi dengan kromosom. Kami menggunakan isolasi DNA
plasmid menggunakan metode kimiawi yakni penambahan bahan-bahan mekanik
seperti EDTA, buffer TE, etanol, PCL(Phenol chloroform/isoamilalkohol,
potasium asetat.

Isolasi DNA kromosom diawali dengan memperbanyak bakteri dengan cara

menumbuhkan bakteri, pemanenan dan kemudian dilakukan pemecahan dinding
sel, selanjutnya dilakukan pemisahan DNA kromosom dari komponen lain. Untuk
memecah dinding sel bakteri, dapat dilakukan dengan cara, yaitu pemecahan
secara fisik ( Freeze Thaw, bead mill homogenization) dan secara kimia dengan
menggunakan reagen reagen kimia seperti lisozim, EDTA, Tris HCL atau dengan
detergen Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Pemecahan dinding sel dengan metode
diatas dapat merusak integritas barier dinding sel sehingga DNA kromosom dapat
keluar, kemudian pemisahan DNA dilakukan dengan sentrifugasi.

prinsip pada isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan persipitasi. Bakteri pada
percobaan ini disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit setelah
dibekukan pada suhu -20 selama 24 jam, diaman didapat endapun putih (pellet)
yang terdapat pada bagian bawah tabung sentrifuga. Hal tersebut dikarenakan
prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih
berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di
atas. Prinsip presipitasi adalah pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang
terdapat dalam sel.

Isolasi DNA plasmid ini menghasilkan pelet yang dikeringkan dan diresuspansi
dalam 20 mikroliter bufer TE, kemudian pelet tersebut disimpan pada suhu 4C
yang disimpan hingga digunakan untuk praktikum selanjumya. Penyimpanan
pelet dalam buffer TE ini berguna untuk mencegah kontaminasi dari lingkungan
sekitar agar DNA plasmid yang akan telah diisolasi tetap dalam kondisi steril
untuk digunakan kembali pada praktikum berikutnya.

VII.KESIMPULAN
 Berdasarkan praktikum kali ini dapat disimpulkan bahwa melakukan isolasi
dna plasmid bakteri merupakan materi gen yang memiliki kemampuan untuk
melakukan replikasi secara otonom.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Departemen kesehatan RI.1989.Materia medika Indonesia.jilid v.Jakarta :
Direktorat jedral pengawasan obat dan makanan.