OPTIMASI METODE LISIS ALKALI UNTUK

MENINGKATKAN KONSENTRASI PLASMID

OLEH :
KELOMPOK 3
1. CUT RINA ULFA
2. KHAIRUNNISA BR. GINTING
3. RABITAH RAHMA
4. IVAN ZIKRI
5. DEA RAMADANIA
 Pengertian Plasmid

Plasmid merupakan molekul DNA ekstrakromosomal yang dapat

memperbanyak diri secara mandiri dan ditemukan dalam sel
prokariotik dan eukariot.

• Penjelasan singkat mengenai plasmid

Secara alami plasmid terdapat pada bakteri dan bebrapa
organisme eukariot seperti saccharomyces ceriviseae. Ukuran
plasmid bervariasi antara 1kb sampai 200kb
 Plasmid mempunyai 3
komponen penting

Origin of replication (ORI)

Dalam penelitian
rekayasa genetika, 01 Sehingga plasmid dapat
beraplikasi secara mandiri.
plasmid digunakan
sebagai transfortasi Mempunyai daerah unik
molekular untuk
memasukkan gen 02 sebagai situs pemotongan enzim
endonuklease
dari luar kedalam
sel inang. Membawa penanda seleksi
terhadap antibiotika untk
03 membedakan sel inang yang
mengandung plasmid atau
tidak
METODOLOGI

Isolasi plasmid Isolasi plasmid pICZ Isolasi plasmid

pJET 1.2/blunt A menggunakan
dari E.coli DH5a Yang bertujuan metode PCR
Yang untuk mengetahui
menggunakan konsentrasi dan
metode alkali lisis pemurnian plasmid
 EMBA H ASAN
P
Isolasi Plasmid bertujuan untuk mengisolasi plasmid rekombinan dari sel kompeten.Isolasi plasmid menggunakan
beberapa larutan yaitu larutan resuspensi yang berfungsi untuk melarutkan sel,larutan ini berisi Tris yang berfungsi
sebagai larutan penyangga, EDTA yang berfungsi untuk mengikat kofaktor agar DNA tidak di degradasi oleh DNA sel
glukosa untuk menjaga tekanan osmosis sel larutan. Larutan lisis berfungsi untuk melepaskan plasmid dari sel E. coli
DH5α, larutan ini berisi SDS yang berfungsi untuk mengikat membrane sel, NaOH berfungsi untuk memecahkan
dinding sel dan mendenaturasi DNA untuk memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom.
Larutan netralisasi berfungsi untuk menetralkan larutan agar DNA plasmid dapat direnaturasi sehingga DNA
plasmid dapat terikat pada membrane silica di spin column. Larutan pencuci yang mengandung etanol berfungsi
untuk mengendapkan DNA plasmid pada membran silica dan menghilangkan garam-garam dan pengotor lainnya.
Larutan elusi berfungsi untuk melarutkan DNA plasmid yang terikat pada membrane silica.
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetic dan berfungsi untuk mengatur perkembangan
biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan
struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA
eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Pada isolasi DNA, pengerjaan nya harus sangat hati-hati
karena DNA sangat mudah rusak oleh enzim DNAse yang terdapat pada kulit, saliva mau pun air mata pemeriksa.
Oleh karena itu selama pengerjaan harus mengenakan sarung tangan dan berbicara sesedikit mungkin.
Buffer lysis dan Proteinase-K disini dipakai sebagai reagen pelisis supaya komponen DNA dalam sitoplasma sel
bisa keluar dan diisolasi. Phenol digunakan untuk mengendapkan komponen protein lain yang tidak dikehendaki
sedangkan etanol 70% sebagai pencuci hasil isolasi. Hasil isolasi DNA diperlihat kan dengan di elektroforesis pada
agarose gel. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi
banyak), sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya
protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA. Jadi pada isolasi DNA ini kita
mendapatkan DNA yang belum benar-benar murni.
Lanjutan…

Isolasi plasmid pICZ A yang bertujuan untuk mengetahui konsentrasi dan pemurnian plasmid karena
merupakan salah satu faktor keberhasilan dari proses kloning DNA. Dengan menggunakan modifikasi
metode kotchoni, penentuan konsentrasi plasmid diukurpada panjang gelombang 260 nm sedangkan
kemurnian plasmid ditentukan dengan membandingkan serapan pada panjang gelombang 260/280 nm.
DNA murni mempunyai nilai antara 1,8 sampai 2,0. Untuk penentuan konsentrasi dan kemurnian
plasmid pICZ A digunakan Nanodrop. Dari hasil penentuan konsentrasi plasmid pICZ A diperoleh antara
3,3 sampai 3,8 µg/µL, sedangkan metode Kotchoni menghasikan plasmid sebanyak 2,0 sampai 2,8
µg/µL. Kemurnian plasmid pICZ A adalah 1, 99 (memenuhi persyaratan). Modifikasi metode Kotchoni
menghasilkan jumlah plasmid lebih banyak dibandingkan metode Kotchoni.
Secara umum, visualisasi hasil isolasi DNA Plasmid menunjukkan kualitas yang relatif rendah,
dikarenakan band atau ukuran pita yang terbentuk kurang jelas atau tipis. Beberapa band atau pita yang
memiliki ukuran yang besar diatas 10.000 bp, hasil tersebut menunjukkan masih adanya kontaminan
berupa DNA genom. Plasmid yang diperoleh kemungkinan dalam bentuk super coil atau nicked (Anonim,
2013). Apabila hasil isolasi DNAnya murni maka akan muncul satu atau dua band. Dilihat dari ukuran
panjang band, DNA yang terlihat mendekati ukuran plasmid yang digunakan yaitu 3197 bp. Sedangkan
ukuran plasmid hasil isolasi yang terlihat diantara ukuran 3000 bp sampai dengan 4000 bp. Hasil yang
berupa pita tipis dapat dipengaruhi banyak faktor. Diantaranya adalah konsentrasi DNA yang digunakan
untuk elektroforesis, kualitas pewarna DNA, serta buffer yang digunakan sebagai fase geraknya elektro
foresis.
Hasil visualisasi plasmid pICZ A menunjukkan bahwa plasmid yang diperoleh dengan modifikasi
metode Kotchoni mempunyai pita yang lebih tebal dibandingkan dengan metode Kotchoni. Modifikasi
Kotchoni mempunyai band lebih tebal karena mempunyai konsentrasi plasmid lebih besar (antara 3,3
sampai 3,8 µg/µL).
Lanjutan…

Uji PCR dilakukan untuk mengetahui keberadaan gen-gen PMQR (misalnya qnr, oqxA, oqxB) yang terletak
di dalam plasmid pada bakteri E.coli yang memang jarang dan hanya memberikan resistensi level rendah, tetapi
mereka dapat menular kan atau menyebar kan sifat resistensi ini secara horizontal diantara kuman E.coli
lainnya dan memfasilitasi sel eksimutan resisten setelah terpapar ciprofloxacin.

Hal ini dikarenakan sifat plasmid, yang menurut Kocsis, bahwa plasmid didefinisikan sebagai molekul DNA
sirkular, beruntai ganda (double-stranded), terletak di luar kromosom bakteri (ekstra- kromosomal) dan
mampu bereplikasi secara otonom serta memiliki peran penting dalam penyebaran gen resistensi seperti gen
ESBL (extended- spectrumbeta-laktama se) dan gen PMQR dari bakteri Entero bacteri aceae spp.

Mekanisme resistensi yang disebabkan oleh gen-gen PMQR ini (qnr, oqxA dan oqx B) adalah:
1. Gen qnr melalui mekanisme perubahan target. Yakni dengan melindungi enzim DNA gyrase dan
topoisomerase IV dari penghambatan fluorokuinolon.
2. Gen oqx AB melalui aktivasi pompa efflux. Yakni dengan meningkatkan efflux yang dihasilkan oleh pompa
Qep AB dan Oqx AB, akibatnya terjadi penurunan akumulasi ciprofloxacin karena dipompa keluar sel.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa semua isolat E.coli MDR ciprofloxacin mempunyai gen gyr A dan
par C pada kromosom nya, yakni pada daerah penentu resistensi kuinolon atau QRDR (Quinolone Resistance
Determining Regions). QRDR adalah bagian permukaan tempat pengikatan DNA dari enzim DNA gyrase (yang
dikode oleh gen gyrA) dan enzim Topoisomerase IV (yang dikode oleh gen par C) dimana substitusi asam amino
dapat mengurangi pengikatan kuinolon atau fluorokuinolon. Umumnya, beberapa mutasi diperlukan untuk
mencapai resistensi yang penting secara klinis didalam Entero bacteria ceae spp; kuman yang resisten kuinolon
hampir selalu ditemukan memiliki satu atau lebih mutasi QRDR.
 KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan sebagai berikut:

1. Isolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur isolasi sel;
lisis dinding dan membran sel; ekstraksi dalam larutan; putrifikasi; dan presipitasi.
2. DNA yang diperoleh cukup murni ditandai dengan nilai rasio A 260/280 berkisar antara 1,8-2,0.
3. Enzim restriksi yang digunakan untuk memotong gen sisipan dan vector harus sama supaya kedua
frageman tersebut memiliki ujung pemotongan yang bersesuaian sehingga dapat saling menempel pada
proses ligase.
4. Metode alkali berhasil dilakukan dalam proses isolasi plasmid pJET 1,2/Blunt dari bakteri Escherichia
coli DH5 α.
5. Resistensi E.coli terhadap antibiotic kelompok aminopenisilin, yaitu: amplisilin, amoksisilin dan
cephalosporin dikarenakan memperoleh plasmid yang mengkode β- lactamase, seperti; TEM-1, TEM-2
atau SHV-1 yang berperan dalam hidrolisa dan inaktivasi antibiotika.
6. Nilai kemurnian DNA plasmid pada konsentrasi urea 5-8 M berada pada kisaran 1,33 dan 1,48
sementara untuk konsentrasi urea 5 M dan 9 M nilai kemurnian turun menjadi sekitar 1,01 dan 0,98.
7. Kosentrasi DNA plasmid paling tinggi diperoleh menggunakan konsentrasi urea 8 M pada kolom dengan
silica gel 25 mg, yaitu sebesar 645 µg/mL
8. DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetika dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
9. QRDR adalah bagian permukaan tempat pengikatan DNA dari enzim DNA gyrase (yang dikode oleh gen
gyrA) dan enzim topoisomerase IV ( yang dikode oleh gen par C) dinamakan substitusi asam amino
dapat mengurangi pengikatan kuinolon atau fluorkuinolon.
10.Larutan netralisasi berfungsi untuk menentralkan larutan agar DNA plasmid dapat direnaturasi
sehingga DNA plasmid dapat terikat pada membran silika di spin column.
THANK
YOU!!