PRAKTIKUM II

ISOLASI DNA PLASMID pTA7002 (35S:: GAL4::VP16::AtRKD4)

I. TUJUAN
Tujuan dari percobaan isolasi plasmid ini adalah untuk mendapatkan plasmid pTA7002
(membawa gen AtRKD4) dari Agrobacterium tumefaciens strain GV 310
II. DASAR TEORI
Plasmid merupakan molekul double stranded (dsDNA) yang berbentuk sirkuler
berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya
bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah . DNA plasmid berukuran lebih kecil dari DNA
kromosom dan dapat bereplikasi sendiri. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan
sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang.
Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin,
interferon, dan berbagai enzim. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan
karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu,
replication origin, marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten
antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar. DNA plasmid
memiliki beribu pasang basa yang panjang ukuran band DNAnya lebih dari 100 kb. Jumlah
plasmid pada bakteri bervariasi, ada yang memiliki jumlah plasmid yang ribuan ataupun tidak
memiliki plasmid. DNA plasmid diduplikasi sebelum pembelahan sel terjadi. Selama
pembelahan sel, setidaknya ada satu DNA plasmid yang disegregasi untuk setiap sel anak.
Banyak plasmid alami yang mempunyai manfaat untuk sel inang, misalnya beberapa plasmid
bakteri mengkode enzim yang menonaktifkan antibiotik (Lodish et al., 2000).
Berdasarkan jumlah plasmid di dalam sel plasmid dibedakan menjadi low copy number
dan high copy number. Low copy number plasmid memiliki kemampuan replikasi yang rendah
sehingga dalam satu sel hanya mengandung satu atau beberapa plasmid yang sama saja.
Sedangkan high copy number plasmid memiliki kemampuan replikasi yang tinggi sehingga
dalam sel mengandung banyak plasmid yang sama hingga ribuan. Bentuk plasmid beragaram,
ada yang berbentuk supercoiled, relaxed circular, supercoiled denature, nicked open circular,
dan linier. Namun pada mikroorganisme tertentu sebagian besar plasmid berbentuk sirkuler
dan linier. Bentuk plasmid beragam akan berpengaruh dalam kecepatan migrasi plasmid dalam
elektroforesis. Semakin kecil bentuk plasmid atau ramping maka akan semakin mudah
bergerak melalui pori gel agarose (Hinnebusch and Barbpur, 1991).
Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor. Vektor akan
membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang dan akan
mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim
(Stanfield, 1996). Menurut Lodish et al (2000), plasmid digunakan dalam DNA Rekombinan
karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA cloning. Replication
region, marker yang memungkinkan adanya seleksi (gen resisten antibiotik) dan region yang
mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar. Plasmid memiliki karakteristik mampu ditransfer
ke bakteri lain dan memiliki ori sehingga plasmid mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan
dari DNA kromosom, Replikasi dimulai dari titik ori sampai semua plasmid tereplikasi. Alasan
plasmid digunakan sebagai DNA vektor karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker
sehingga dapat dikonfirmasi apakah gen yang disisipkan dapat masuk dan berasosiasi dengan
DNA plasmid atau tidak, selain itu plasmid memiliki copy number yang besar dan mudah
dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu yang diinginkan. DNA vektor yang sering
digunakan adalah plasmid yang berukuran antara 1-250 kb (Brown, 2010).
Tiga tahapan penting dalam isolasi plasmid yaitu pelisisan membran sel bakteri,
ekstraksi DNA, dan pengendapan DNA. Bakteri yang akan diisolasi DNA plasmidya perlu
dilakukan kultivasi terlebih dahulu untuk memberikan kesempatan bagi bakteri agar bisa
memperbanyak diri, sehingga plasmid yang didapatkan pada saat pemanenan akan banyak.
Proses lisis diawali dengan pemberian SDS (Sodium dodesil sulphate) + NaOH. SDS berperan
untuk melisiskan dinding membrane sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai
larutan basa yang berfungsi untuk mendenaturasi protein atau DNA (yang semula DNA adalah
double stranded menjadi single stranded DNA). Terjadinya proses lisis ditandai dengan
terbentuknya lendir (Saunders and Parkers, 1999). Selanjutnya ekstraksi dilakukan dengan
penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol). Phenol berfungsi untuk mengikat
protein dan sebagian kecil RNA, chloroform berfungsi untuk membersihkan protein dan
polisakarida dari larutan. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah
disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas, protein
yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling
bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar. Proses ekstraksi diakhiri dengan
adanya proses pengendapan DNA menggunakan sodium acetat dan alcohol. Larutan DNA
terkonsentrasi dan ketika disentrifugasi DNA akan mengendap (Syarafuddin dan Santoso,
2011).
III. METODE
A. ALAT
Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain, tabung 1,5 ml tipe eppendorf,
mikropipet, pipet tip, sentrifuge, spidol marker, 1 set alat elektroforesis, UV
transilluminator, vortex, dan kamera digital.
B. BAHAN
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain kultur bakteri Agrobacterium
tumefaciens dalam medium L-Broth, solution I, solution II, solution III, PCI (Phenol
Chloroform Isoamyl alcohol), ethanol absolut, etahanol 70%, TE, dan RNAs. Sedangkan
untuk analisis elektroforesis dibutuhkan gel agarose, TBE 1X, SBYR Safe, marker DNA /
Sty I, Bromphenol Blue, dan sampel DNA plasmid.
C. CARA KERJA
Metode yang dilakukan untuk percobaan isolasi DNA plasmid ini adalah dengan
metode alkali lisis. Proses awal yang dilakukan sebelum isolasi plasmid adalah kultur bakteri
pada medium L-Broth dan mengandung antibiotik (kanamisin dan rimfapisin) yang telah
diinokulasi. Selanjutnya sel bakteri dipanen dengan sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm
selama 30 detik. Supernatan dibuang dan ditambahkan solution I dingin sebanyak 100 l
pada tabung yang berisi pellet dan divortex. Setelah divortex diinkubasi pada suhu kamar 5
menit. Selanjutnya ditambahkan solution II sebanyak 200 l dan diinversi sebanyak 4-6 kali.
Diinkubasi pada suhu 0C selama 5 menit. Ditambahkan solution III 150 l dan diinversi,
kemudian diinkubasi kembali pada suhu 0C selama 10 menit. Selesai inkubasi, dilakukan
sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil dan ditambah
PCI (1:1) kemudian divortex. Langkah selanjutnya adalah sentrifugasi pada kecepatan
12.000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dimasukkan ke dalam tube baru dan
ditambahn etanol absolut dingin sebanyak 2x volume supernatan yang diambil. Divortex dan
didiamkan selama 2 menit, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 5
menit. Etanol absolut dibuang, pellet dikoleksi kemudian ditambah ethanol 70% sebanyak 1
ml. Disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, etanol dibuang dan dikering
anginkan. Pellet dikoleksi dan diresuspensi dengan TE sebanyak 50 l dan ditambah RNAse
1 l. Selanjutnya dilakukan analisis kualitatif dengan elektroforesis.
Selanjutnya untuk elektroforesis ditimbang agarose konsentrasi 0,7 % yaitu
sebanyak 0, 175 gr dan dilarutkan dalam 25 ml TBE 1x. Campuran agarose dan TBE tersebut
dipanaskan hingga larut sempurna. Didiamkan pada suhu kamar sampai laurtan agarose tidak
terlalu panas 70C, setelah suhu larutan agarose mencapai suhu 70C ditambahkan SYBR
safe sebanyak 3 l dan digoyang hingga SYBR safe rata dalam larutan agarose. Agarose
dituang ke dalam cetakan sumuran yang telah disiapkan. Apabila gel agarose telah menjendal
sisir susmuran diangkat dan gel agarose diletakkan di tangki elektroforesis dan direndam
dalam TBE 1x. Sumuran dibersihkan dari sisa-sia gel yang mengganggu dengan sped injeksi.
Gel siap digunakan.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

DNA plasmid yang digunakan pada percobaan ini adalah plasmid dari
Agrobacterium tumefaciens yaitu plasmid pTA7002 yang membawa gen AtRKD4. Tiga tahap
utama dalam isolasi DNA adalah pelisisan membran sel bakteri, ekstraksi DNA, dan
pengendapan DNA. Bakteri dipanen terlebih dahulu sebelum diisolasi dnegan sentrifuge pada
kecepatan 12.000 rpm selama 30 detik. Berikut adalah hasil dari panen sel bakteri A.
tumefaciens :

pellet

Gambar 1. Pemanenan sel bakteri dengan sentrifugasi

 Berdasarkan Gambar 1 tersebut dapat dilihat bahwa terbentuk 2 lapisan. Pada
pemanenan ini gaya sentrifugal memisahkan massa sel bakteri yang bebrbentuk padat dari
cairan media pertumbuhan. Massa sel terendapkan pada dasar tabung sebagai pellet.
Isolasi DNA plasmid dengan metode lisis alkali meliputi proses resuspensi sel, lisis
sel, dan netralisasi (Sambrook dan Russell, 2001). Pada proses isolasi plasmid ini digunakan
tiga macam solution, yaitu solution I yang terdiri dari Glukosa, Tris HCl, dan Na-EDTA.
Solution I ini berfungsi sebagai resuspensi, dengan konsentrasi glukosa yang tinggi masuk ke
dalam sel, maka akan membuat membran sel menjadi rusak. Selanjutnya pemberian solution
II yang terdiri dari NaOH dan SDS dalam keadaan yang fresh. NaOH sebagai alkali, yang
berfungsi merusak membran sel sehingga menyebabkan DNA kromosom dan plasmid
terdenaturasi. Dan dalam step ini perlu kita ingat bahwa tidak boleh divortex pada saat mix.
SDS juga berfungsi untuk menghancurkan membran sel. Kalau divortex, semua akan hancur
termasuk DNA-nya (NaOH adalah alkali kuat) atau nanti dapat juga DNA plasmid akan
bergabung dengan chromosomal DNA. Sedangkan solution III berguna untuk neutralization,
pada tahap ini dapat dilihat membran-membran yang telah lisis menggumpal dan menyatu
atau DNA kromosom dan plasmid mengalami renaturasi. Lisis sel ditandai dengan
terbentuknya lendir dan cairan bening (Aini dkk., 2011).
Selanjutnya pemurnian DNA dilakukan dengan ekstraksi fenol klorofom isoamil
alkohol. Prinsip metode pemurnian DNA plasmid menggunakan ektraksi FKI didasarkan pada
perbedaan kelarutan DNA dan protein di dalam pelarut organik. DNA plasmid akan terlarut
dalam lapisan yang lebih polar (lapisan aqueous), protein berada di antara lapisan atas dan
bawah sedangkan lapisan bawah merupakan fase organik (Sambrook dan Russell, 2001).
Penambahan FKI dapat dilihat pada Gambar 2 :
 Gambar 2. Pemurnian DNA plasmid dengan penambahan FKI
Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dan supernatan diambil, kemudian ditambahkan
ethanol absolut dingin. Fungsi dari penambahan etanol absolut ini adalah untuk memisahkan
DNA dari larutan (presipitasi DNA). Setelah perlakuan itu, DNA akan terpresipitasi dan pellet
akan didapatkan dengan sentrifugasi. Selanjutnya pellet yang diperoleh dicuci dengan etanol
70%, kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Etanol
70% tersebut dibuang dan pellet dikering anginkan. Tujuan dari pengering anginan etanol ini
adalah agar pellet DNA dapat larut dalam buffer tris EDTA (TE). Berikut adalah hasil
resuspensi DNA dalam TE :

Gambar 3. Resuspensi pellet DNA dengan TE

Berdasarkan Gambar 3 tersebut dapat dilihat bahwa pellet DNA terbentuk didasar
tabung dengan warna putih bening. DNA kemudian ditambahkan RNAse untuk mendegradasi
kontaminan RNA. DNA plasmid yang telah diperoleh dapat dianalisis dengan elektroforesis
untuk melihat dan memastikan bahwa isolasi DNA plasmid berhasil dilakukan. Elektroforesis
dilakukan dengan pembuatan gel agarose terlebih dahulu. Konsentrasi yang digunakan dalam
pembuatan gel agarose adalah 0,7% dalam 25 ml TBE 1X dan dirunning dengan besaran
voltase 50 volt. Marker DNA yang digunakan adalah / Sty I. Pada saat akan menjalankan
analisis elektroforesis perlu disiapkan sampel DNA plasmid yang akan dirunning yang
masing-masing diambil 10 l dan ditambah dengan DNA loading dye sebanyak 2 l, serta
marker / Sty I sebanyak 3 l. Berikut adalah hasil elektroforesis DNA plasmid yang telah
diisolasi :

Gambar 4. Hasil elektroforesis DNA Plasmid, Keterangan ; M = Marker, p(1)

= plasmid 1, p(2) = plasmid 2, p(3) = plasmid 3

Berdasarkan Gambar 4 dapat diketahui bahwa sampel DNA plasmid yang

dianalisis dengan elektroforesis memperlihatkan adanya 2 band yang terbentuk. Padahal
seharusnya terbentuk 3 band DNA plasmid, yaitu plasmid berbentuk superheliks (ccc =
covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari well, pita DNA plasmid yang berada
di tengah berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan well adalah pita
DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler. Semakin kompak suatu DNA maka akan
bermigrasi semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh
dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak
dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier. Panjang DNA
plasmid pTA7002 adalah 14308 bp. Berdasarkan hasil yang diperoleh dari Gambar 4 tersebut
bahwa DNA plasmid menunjukkan panjang DNA berada di antara 7,74 kbp dan 19,33 kbp.

V. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa DNA plasmid yang
diisolasi dan setelah dianalisis elektroforesis DNA plasmid memiliki ukuran pita berada
diantara 7,74 kbp dan 19,33 kbp. Band yang terbentuk adalah double band.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Aini, A.N., Purbowatiningrum R.S., A. L.N. Aminin. 2011. Pemurnian DNA Plasmid
Puc19 Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea. Jurnal Sains dan
Matematika. 19(2):47-53.
Brown, T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. Wiley-Blackwell.
ISBN 978-1-4051-8173-0. Hal. 35-36.
Lodish, H., B. Arnold, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, and J. Darnell. 2000.
Molecular Cell Biology. 4th edition. W.H.Freeman Comp. USA.
Sambrook, J. and Russell, D. W. 2011. Molecular Clonning : A Laboratory Manual. 3rd
edtition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Syafaruddin, E.R. dan T.J Santoso. 2011. Efektivitas dan efisiensi teknik isolasi dan
purifikasi DNA pada jambu mete. Buletin RISTRI (2)2: 151-160