ISOLASI DNA PLASMID

Oleh :
Nama : Salman Zaul ‘Ammar
NIM ; B1A021070
Kelompok :1
Rombongan :I
Asisten : Berliana Amelia

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2023
A. Tujuan

Tujuan dari praktikum Rekayasa Genetika Acara 2 yaitu untuk

mengisolasi dan menduga konformasi DNA plasmid bakteri.
B. Materi

Bahan-bahan yang digunakan pada acara isolasi DNA plasmid yaitu

meliputi E. coli dalam media LB dan GeneJET Plasmid Miniprep Kit
(resuspension solution, lysis solution, neutralization, wash solution, elution
buffer).
Alat-alat yang digunakan pada acara isolasi DNA plasmid yaitu
meliputi mikropipet beserta tip, mesin sentrifugasi, freezer, microtube, spin
column, vortex, bunsen, seperangkat alat elektroforesis, masker dan sarung
tangan serta alat tulis.
C. Prosedur Kerja

Kultur E. coli 1 mL dimasukkan ke dalam microtube, lalu

disentrifuse dengan kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit

Supernatan dibuang dan pellet ditambahkan 250µL

resuspension solution dan 15µL RNAse. Kemudian divorteks
selama 1 menit lalu ditambahkan 250µL lysis solution dan 350µL
neutralization solution, homogenkan. Kemudian disentrifuse
12.000 rpm selama 5 menit.

Supernatant dipindah microtube baru dan ditambahkan 375µL

binding buffer, 10µL proteinase-K, lalu divorteks selama 1
menit.

Kemudian dipindah ke spin column lalu disentrifuse 12.000 rpm

selama 1 menit. Cairan pada collection tube dibuang lalu pellet
ditambahkan 500µL wash buffer dan disentrifuse 12.000 rpm
selama 1 menit, dilakukan sebanyak 2 kali.

Spin column dipindahkan ke microtube baru dan ditambahkan

100µL elution buffer, lalu inkubasi selama 2 menit pada suhu
ruang. Selanjutnya disentrifuse 12.000 rpm selama 2 menit.
Kemudian dilakukan elektroforesis.
D. Hasil dan Pembahasan

Plasmid merupakan DNA untai ganda ekstrakromosomal,berbentuk

sirkuler dan/atau linear yang dapat bereplikasi secara independen. Plasmid
sering digunakan sebagai alat untuk memasukkan gen asing ke dalam bakteri
dengan tujuan memproduksi protein rekombinan dan kloning gen yang
diinginkan (Patigu et al., 2021). Secara alami plasmid terdapat pada bakteri
dan beberapa organisme eukariot seperti Saccharomyces ceriviseae. Ukuran
plasmid bervariasi antara 1 kb sampai 200 kb. Dalam penelitian rekayasa
genetika, plasmid digunakan sebagai kendaraan molekuler untuk
memasukkan gen dari luar ke dalam sel inang. Plasmid mempunyai 3
komponen penting yaitu, yang pertama Origin of replication (ORI), sehingga
memungkinkan plasmid dapat bereplikasi secara mandiri. Kedua, mempunyai
daerah unik sebagai situs pemotongan enzim endonuclease, yang biasa
disebut multiple cloning site (MCS). Ketiga, membawa penanda seleksi
(biasanya resistensi terhadap antibiotika) untuk membedakan antara sel inang
yang mengandung plasmid atau tidak (Hardianto et al., 2015).
Sistem penamaan plasmid menggunakan huruf dan angka. Sebagai
contoh pBR322, p berarti pasmid, BR merupakan nama orang yang pertama
kali mengkonstruksi plasmid (Bolivar dan Rodriquez), dan 322 merupakan
nomor identitas spesifik dari plasmid (Hardianto et al., 2015). pUC19 adalah
salah satu dari serangkaian vektor kloning plasmid yang dibuat oleh Joachim
Messing dan rekan-rekannya (Yanisch-Perron et al., 1985). Sebutan "pUC"
berasal dari awalan "p" klasik (menunjukkan "plasmid") dan merupakan
singkatan dari Universitas California, tempat penelitian awal terhadap seri
plasmid dilakukan. DNA ini merupakan DNA untai ganda berbentuk bundar
dan memiliki 2.686 pasangan basa. pUC19 adalah salah satu molekul vektor
yang paling banyak digunakan karena rekombinan, atau sel di mana DNA
asing telah dimasukkan, dapat dengan mudah dibedakan dari non-rekombinan
berdasarkan perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan. pUC18 mirip
dengan pUC19, tetapi wilayah MCS terbalik (Vieira & Messing, 1982).
Praktikum Rekayasa Genetika Acara 2 ”Isolasi DNA Plasmid” yaitu
bertujuan untuk mengisolasi dan menduga konformasi DNA plasmid bakteri.
Pada acara ini isolasi DNA plasmid berasal dari bakteri E. coli dengan
 menggunakan kit isolasi GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Hasil isolasi
kemudian dicek menggunakan metode elektroforesis.

Gambar 1. Hasil Elektroforesis pita DNA plasmid E. coli

Gambar 1 di atas menunjukkan hasil elektroforesis dari DNA plasmid

Escherichia coli. Dari hasil tersebut ukuran pita plasmid yang terbentuk baik pada
kelompok 1, kelompok 2, kelompok 3, maupun kelompok 4 memiliki nilai di atas
50bp namun tidak diketahui secara pasti ukuran aslinya. Menurut Sundari dan Priadi
(2019), Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan
menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini
berfungsi sebagai pembanding sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA
sampel. Berdasarkan pustaka tersebut, maka ukuran pita DNA pada praktikum yang
kami lakukan tidak dapat diketahui secara pasti namun dapat dikatakan memiliki
nilai di atas 50bp dikarenakan posisi pita DNA plasmid sampel berada lebih tinggi
atau terletak di atas pita DNA ladder yang berukuran 50bp.
Berdasarkan gambar 1 hasil elektroforesis DNA plasmid E. coli pada
kelompok 1, kelompok 2, kelompok 3, dan kelompok 4 memiliki hasil yang jelas
(clear) Menurut Sundari dan Priadi (2019), semakin tebal, tegas, dan utuh DNA yang
diperoleh akan membuat kuantitas dari DNA semakin bagus. Menurut Adi et al.
(2011), struktur konformasi plasmid pUC19, berbentuk sirkuler dan memiliki
panjang 2686 bps dan memiliki multiple cloning site (MCS), yaitu tempat
menyisipkan DNA, origin of replication (ORI) dan gen resistensi terhadap antibiotik
yakni gen tahan terhadap ampisilin serta mengandung gen pengahasil beta-
galaktosidase.

Referensi :

Adi, A. A. A. M., Kardena, I. M., Astawa, N. M., Putra, K. S. A., Hayashi, Y., &
Matsumoto, Y., 2011. Kloning, Sikuensing dan Analisis Filogenetik Gen
Nukleokapsid Protein Virus Tetelo Isolat Bali-1/07. Jurnal Veteriner, 12(3),
pp. 173-179.
Hardianto, D., Indarto, A., Sasongko, N. D., 2015. Optimasi Metode Lisis Alkali
untuk Meningkatkan Konsentrasi Plasmid. Jurnal Bioteknologi Biosains
Indonesia, 2(2), pp. 60-64.
Sundari, S., & Priadi, B., 2019. Teknik Isolasi dan Elektroforesis Dna Ikan Tapah.
Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur, 17 (2), pp. 87-90. Doi:
http://dx.doi.org/10.15578/blta.17.2.2019.87-90.
Patigu, R. F., Wijayanti, P., Sebastian, A., & Purwestri, Y. A., 2021. Optimization of
Heat Shock Temperature and Time on the Transformation of pRGEB32 into
Escherichia coli DH5à ±. Jurnal Biologi Tropis, 21(3), pp. 632-640.

Vieira, J., & Messing, J., 1982. The pUC Plasmids, an M13mp7-derived System for
Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Primers.
Gene, 19(3), pp. 259–268.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J., & Messing, J., 1985. Improved M13 Phage Cloning
Vectors and Host Strains: Nucleotide Sequences of the M13mp18 and
pUC19 Vectors. Gene, 33 (1), pp. 103–119.