PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI

Oleh :
Nama : Salman Zaul ‘Ammar
NIM ; B1A021070
Kelompok :1
Rombongan :I
Asisten : Berliana Amelia

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2023
A. Tujuan

Tujuan dari praktikum Rekayasa Genetika Acara 3 yaitu untuk

mengetahui pola pemotongan dan ukuran DNA hasi pemotongan.
B. Materi

Bahan-bahan yang digunakan pada acara kali ini yaitu meliputi DNA
plasmid, enzim EcoRI, buffer EcoRI, dan ddH2O.
Alat-alat yang digunakan pada acara kali ini yaitu meliputi mikropipet
beserta tip, PCR tube, water bath, seperangkat alat elektroforesis, masker dan
sarung tangan serta alat tulis.
C. Prosedur Kerja

Sebanyak 10µL DNA plasmid dimasukkan kedalam PCR tube.

Kemudian ditambahkan dengan 7µL ddH2O, 2µL buffer EcoRI,

dan 1µL enzim restriksi EcoRI secara urut, lalu diinkubasi dengan
water bath pada suhu 37℃ selama 1 jam.

Jika DNA plasmid belum terpotong maka waktu inkubasi akan

ditambah. Jika sudah terpotong sampel dipanaskan pada suhu
70℃.

Setelah diinkubasi selama 1 jam dilanjutkan dengan

elektroforesis.

D. Hasil dan Pembahasan

Plasmid merupakan DNA untai ganda ekstrakromosomal, berbentuk

sirkuler dan/atau linear yang dapat bereplikasi secara independen (Patigu et
al., 2021). Ukuran plasmid bervariasi antara 1 kb sampai 200 kb. Dalam
penelitian rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai kendaraan
molekuler (vector) untuk memasukkan gen dari luar ke dalam sel inang
(Hardianto et al., 2015). Vektor turunan pUC memiliki penggunaan yang luas
dalam biologi molekuler karena menunjukkan jumlah salinan yang tinggi,
stabilitas genetik, dan berbagai tempat kloning untuk manipulasi DNA.
Vektor pUC18 dan pUC19 adalah plasmid berukuran kecil dengan jumlah
salinan tinggi yang banyak digunakan untuk kloning dan manipulasi fragmen
DNA (Xavier et al., 2009). Pada praktikum Rekayasa Genetik, acara 3
menggunakan plasmid pUC19 dengan enzim restriksi EcoRI.

Gambar 1. Hasil Elektroforesis Gambar 2. Hasil Elektroforesis

DNA plasmid E. coli pUC19 dengsn EcoRI

Gambar 2 di atas menunjukkan hasil elektroforesis dari vektor pUC19

yang telah direstriksi menggunakan enzim restriksi EcoRI. Dari hasil tersebut
diperoleh 2 buah pita DNA pada tiap kelompok dengan ukuran masing-
masing pita DNA memiliki nilai di atas 50bp namun tidak diketahui secara
pasti ukuran aslinya. Menurut Sundari dan Priadi (2019), Elektroforesis dapat
digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA
marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai
pembanding sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel.
Berdasarkan pustaka tersebut, maka ukuran pita DNA pada praktikum yang
kami lakukan tidak dapat diketahui secara pasti namun dapat dikatakan
memiliki nilai di atas 50bp dikarenakan posisi kedua pita DNA dari pUC19
berada lebih tinggi atau terletak di atas pita DNA ladder yang berukuran 50bp
dengan catatan pita DNA pUC19 yang terletak di atas memiliki ukuran yang
lebih besar dari yang di bawah. Semakin bawah letak pita DNA, maka
semakin kecil ukurannya. Menurut Nugraha et al. (2014), prinsip kerja dari
elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel, makin kecil ukuran
molekulnya maka makin cepat laju migrasinya, karena matriks gel
mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel
tersebut dapat bergerak melalui matriks.
Berdasarkan gambar 1 hasil elektroforesis DNA plasmid E. coli dan
gambar 2 hasil elektroforesis pUC19 dengsn EcoRI memiliki hasil yang jelas
(clear). Pada gambar 1 hanya terbentuk satu pita DNA pada tiap kelompok
seedangkan pada gambar 2 terdapat dua pita DNA pada tiap kelompok. Hal
ini dikarenakan plasmid terpotong oleh enzim restriksi EcoRI sehingga
menghasilkan dua pita DNA dengan ukuran yang berbeda. Menurut Latifah et
al. (2017), pemotongan DNA dengan enzim restriksi menghasilkan dua
jenis ujung potongan, yaitu ujung rata (blunt-end) dan ujung tidak rata
(sticky-end). Hasil pemotong ujung sticky-end dapat menghasilkan ujung
5’atau ujung 3’. Enzim EcoRI menghasilkan potongan sticky-end dengan
memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GA ATTC dan
hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Kemudian dari hasil
bentuk pita DNA pada gambar 1 dan gambar 2 memiliki bentuk yang
berbeda. Pada gambar 1 pita DNA memiliki bentuk yang lebih lebar atau
sedikit menggembung hal ini dikarenakan ketika DNA plasmid yang
berbentuk sirkular dipanaskan secara elektrik pada elektroforesis akan
membentuk struktur DNA yang supercoil, sedangkan pada gambar 2 plasmid
pUC19 yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI menjadi dua
potong pita DNA menghasilkan bentuk yang pipih. Menurut Adi et al. (2011),
struktur konformasi plasmid pUC19, berbentuk sirkuler dan memiliki panjang
2686 bps dan memiliki multiple cloning site (MCS), yaitu tempat
menyisipkan DNA, origin of replication (ORI) dan gen resistensi terhadap
antibiotik yakni gen tahan terhadap ampisilin serta mengandung gen
pengahasil beta-galaktosidase.
Referensi :

Adi, A. A. A. M., Kardena, I. M., Astawa, N. M., Putra, K. S. A., Hayashi, Y., &
Matsumoto, Y., 2011. Kloning, Sikuensing dan Analisis Filogenetik Gen
Nukleokapsid Protein Virus Tetelo Isolat Bali-1/07. Jurnal Veteriner, 12(3),
pp. 173-179.
Hardianto, D., Indarto, A., Sasongko, N. D., 2015. Optimasi Metode Lisis Alkali
untuk Meningkatkan Konsentrasi Plasmid. Jurnal Bioteknologi Biosains
Indonesia, 2(2), pp. 60-64.
Latifah, D. A., Priyadi, D., Maharani, Kustantinah & Hartatik. T., 2017.
GeneticAnalysis Using Partial Sequencing of Melanocortin 4 Receptor
(MC4R) Gene in Bligon goat. Media Peternak. 40(7), pp. 1–77.
Sundari, S., & Priadi, B., 2019. Teknik Isolasi dan Elektroforesis Dna Ikan Tapah.
Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur, 17 (2), pp. 87-90. Doi:
http://dx.doi.org/10.15578/blta.17.2.2019.87-90.
Patigu, R. F., Wijayanti, P., Sebastian, A., & Purwestri, Y. A., 2021. Optimization of
Heat Shock Temperature and Time on the Transformation of pRGEB32 into
Escherichia coli DH5à ±. Jurnal Biologi Tropis, 21(3), pp. 632-640.

Xavier, M. A., Kipnis, A., Torres, F. A., & Astofi-Filho, S., 2009. New Vectors
Derives from pUC 18 for Clonig and Thermal-Induced Expression in
Escherichia coli. Brazilian journal of microbiology, 40(4), pp. 778–781.
https://doi.org/10.1590/S1517-83822009000400007.