Laporan Praktikum

PRAKTIKUM XI

ELEKTROFORESIS HASIL PRAKTIKUM VIII DAN IX

Dosen Pembimbing :

Wahyu Hidayati, S.Si., M.Biomed.

Disusun Oleh :

Riski Nabillah Putri

1804034084

2D

PROGRAM STUDI D4 ANALISIS KESEHATAN

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF.DR.HAMKA

JAKARTA

TAHUN 2019
 BAB I

PENDAHULUAN

I.I Latar Belakang

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya,
yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang
merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set
lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom.
DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan.Metode standar yang
digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis
gel agarosa. Hasil dari berbagaimanipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses
elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan
meletakkannya pada suatu medan listrik.

Elektroforesis merupakan pergerakan dari molekul bermuatan listrik pada medan arus listrik,
maka molekul bermuatan negatif akan bergerak keelektroda bermuatan positif (kutub positif) dan
molekul bermuatan positif akan bermigrasi ke arah kutub negatif. Elektroforesis digunakan untuk
mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya
band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan
jumlah pasangan basanya. Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan
bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. (Sudjadi, 2008)

Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan,
ukuran dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran
potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient
sentrifugasi. Saat arus listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah
menuju elektroda positif. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan di dalam teknik
analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat
sekali di zaman kemajuan teknologi, di sebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat
mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan
untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan maupun tumbuhan.

I.II Tujuan

Praktikum dilakukan untuk memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan
metode elektroforesis, dan praktikan mampu menggunakan alat elektroforesis dengan baik dan benar
sehingga dapat memahami prinsip dasar dari elektroforesis agarose.
 BAB II

MATERI DAN METODE

II.I Waktu dan Tempat

Praktikum dilaksanakan pada pukul 12.30 WIB hari rabu, 3 Juli 2019. Adapun tempat
dilaksanakannya praktikum adalah Laboratorium Bioteknologi Lt.4 Fakultas Farmasi dan Sains
Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka.

II.II Alat dan Bahan

Alat-alat yang di gunakan pada praktikum kali ini meliputi peralatan elektroforesis, hot
plate, cling wrap, mikropipet, tips untuk mikropipet dan UV Transilluminator. Sedangkan pada
bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu, buffer TAE 1x, bubuk agarose, 6x loading
dye, DNA ladder dan SyBr Green.

II.III Metode Kerja

Pada pembuatan agarose 1 % yaitu,

1. ditimbang agarose sebanyak 1 gram dengan menggunakan timbangan analitik

2. dimasukkan ke dalam erlenmeyer
3. dituangkan buffer TAE 1x sebanyak 100 mL ke dalam erlenmeyer tersebut
4. dipanaskan dengan menggunakan hot plate hingga mendidih
5. ditambahkan 4 ul SyBr Green ke dalam agarose setelah suam-suam kuku
6. dihomogenkan
7. dituang cairan agarose 1% ke dalam cetakan
8. dimasukkan comb
9. ditunggu hingga agarose mengeras

Pada Proses elektroforesis yaitu,

1. dilepaskan comb dari agarose yang telah keras

2. diletakkan dalam tank
3. dituang buffer TAE 1x hingga agarose terendam
4. dicampur 1 ul 6x loading dye dengan 3 ul sampel DNA
5. dihomogenkan dengan cara di pippeting
6. dimasukkan ke dalam well
7. dimasukkan 3 ul DNA ladder ke dalam well
8. ditutup tank
9. dijalankan elektroforesis pada tegangan 100 V selama 30 menit
10. diletakkan agarose pada UV Transilluminator
 BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

III.I Hasil

Gambar 1. Visualisasi DNA Hasil Elektroforesis

III.II Pembahasan

Berdasarkan hasil visualisasi DNA setelah di elektroforesis diperoleh bahwa pita DNA marka
tidak muncul, sedangkan DNA sampel menghasilkan pita-pita DNA. Hal tersebut dapat terjadi
karena DNA marka terdenaturasi sebelum di elektroforesis, penyimpanan DNA marka setelah
selesai digunakan tidak disimpan kembali pada lemari pendingin. Menurut Standfield et al.(1996),
kemungkinan terjadinya kegagalan tersebut karena DNA telah mengalami depolarisasi. Perlu
diperhatikan bahwa pemberian arus listrik pada gel agarosa tidak boleh sembarangan karena jika
terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akan merubah bentuk pita DNA. Beberapa
kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA tidak terbetuk seperti seharusnya, diantaranya
adalah DNA dimasukan dalam sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut,
perendaman yang terlalu lama pada TAE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di
gelagarosa.

DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis
cahaya yang muncul pada gel. Waktu yang paling optimal dalam elektroforesis yang sebenarnya
adalah 30 – 50 menit dengan menggunakan arus 50mA. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya
terdiri atas 4 pita yaitu, opencircular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut
mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal
tersebutmenyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya
(Sambrook & Russel 2001).

Menurut Pratiwi (2001), elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan

pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Klug and Cummings (1994) menambahkan bahwa elektroforesis
adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan
dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-
partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif
(anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub
negatif (anode). Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel
DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa
digunakan antara lain gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukanuntuk memisahkan
sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Prinsip dasar
tekhnik elektroforesis ini adalah DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Elektroforesis gel biasanya dilakukanuntuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai
tekhnik preparatif (Standfield 1996).

Menurut Rachmaniar (1998), agarosa merupakan polimer dari 3,6-Anhidro-L-galaktosa

dengan b-d-galaktosa, yang memiliki komponen netral atau tidak bermuatan. Agarosa merupakan
polisakarida yang diekstrak dari rumput laut,rumput laut yang digunakan yaitu Evchema spinosum
atau bisa juga dari jenis golongan Phaephycophyta. Agarosa akan membentuk gel padat jika
dilarutkan dengan pemanasan pada konsentrasi antara 0,5% dan 2%. Agarosa yang digunakan
untuk elektroforesis lebih murni bila dibandingkan dengan agar yang digunakan untuk kultur
bakteri. Agarosa akan membentuk pori yang besar sesuai dengankonsentrasi agarosa.

Sambrook and Russel (2001), menambahkan bahwa gel ini mengandung larutan buffer Tris
Asetat EDTA (TAE) yang dapat memberikan resolusi terbaik untuk DNA. Gel agarosa mempunyai
laju pemisahan lebih cepat, dapat memisahkan fragmen DNA antara 100 bp–50 kb tergantung dari
konsentrasi gelagarosa yang digunakan, medan gerak biasanya horizontal. Fungsi dari masing-
masing alat dan bahan yang digunakan pada praktikum elektroforesis adalah:

1. Sarung tangan, digunakan untuk mencegah keringat dari tangan pada mediumkarena keringat
mengandung DNAase dan melindungi toksik dari SyBr. Selama pengerjaan harus mengenakan
sarung tangan dan berbicara sesedikit mungkin(Faatih, 2009).

2. Mikropipet, digunakan untuk mengambil sampel DNA.

3. Transiluminator, digunakan untuk mengvisualisasi DNA yang sudah dirunning.

4. Kertas parafilm, digunakan untuk mencampur atau menghomogenkan sampelDNA dengan

loading dye

5. Sisir elektroda, digunakan untuk membuat sumur untuk melekatkan DNA.

6. SyBr digunakan sebagai pewarna yang menyisip pada pasang basa yang akan menunjukan
posisi fragmen-fragmen dengan ukuran berbeda.

7. Loading dye digunakan sebagai pemberat ( Bromophenol blue sebagai penanda jalannya
elektroforesis, xylene cyalol sebagai penanda awal jalannya elektroforesis).

8. Larutan buffer TAE 1X (tris-base sebagai penyeimbang pH, asam asetat glasial sebagai
elektrolit dan EDTA, digunakan untuk menginaktifkan enzim perusak DNA yaitu DNAase).

9. Agarosa, digunakan untuk memadatkan dan mengvisualisasi DNA.

10. Seperangkat elektroforesis, sebagai alat untuk elektroforesis DNA dengan 70 Vselama 35
menit.
 BAB IV

KESIMPULAN

IV.I Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil dan pembahasan dengan
kesimpulan sebagai berikut, yaitu prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-
molekul bermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya. DNA
bermuatan negatif sehingga DNA akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan partikel-
partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Semakin padat
gel agarosa dan berat molekul DNA maka akan semakin lambat laju migrasinya. Elektroforesis
merupakan metode analisis fisika berdasarkan kecepatan migrasi partikel bermuatan yang
terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit dibawah medan listrik. Pemisahan terjadi
tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Pada praktikum kali ini di dapat hasil visualisasi DNA
setelah di elektroforesis diperoleh bahwa pita DNA marka tidak muncul, sedangkan DNA sampel
menghasilkan pita-pita DNA. Hal tersebut dapat terjadi karena DNA marka terdenaturasi sebelum
di elektroforesis, penyimpanan DNA marka setelah selesai digunakan tidak disimpan kembali pada
lemari pendingin.

IV.II Saran

Pelaksanaan praktikum lebih bekerja secara aseptis dan teliti. Penggunaan sampel DNA yang
digunakan lebih diperhatikan agar tidak terjadi denaturasi. Selanjutnya dalam pelaksanaan
praktikum tidak hanya demo dalam penggunaan alat agar semua praktikan dapat mengetahui
secara detail penggunaan alat.
 DAFTAR REFERENSI

Fatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi,
10(1):61 – 67.

Fatchiyah. 2006. Electroforesis Migration Rate. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler dan
Seluler Universitas Brawijaya, Malang.

Klug, W. S. and M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall,Englewood
cliffs.

Pramono, H. 2011. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed. Purwokerto.

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1. Balitbang
Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta.

Rachmaniar. 1998. Pemisahan Agarosa dari Polisakarida Agar. Buku Produk Alam Laut I. Puslit
Oseanografi LIPI, Jakarta

Sambrook, J., Russel D. W. 2001.Ed. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Stanfield, W. D., Jaime S. C., Raul J. C. 1996.Molecular and Cell Biology. McGraw-Hill, New
York.
LAMPIRAN